子宮平滑肌瘤組織中孕激素受體和porin mRNA的表達

封全靈，劉弘揚

鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州450052

△女，1965年4月生，博士，主任醫師，研究方向:婦科腫瘤，E-mail:zzufql@126.com

孕激素促進子宮平滑肌瘤生長的確切機制尚不清楚。傳統觀念認為子宮平滑肌瘤的形成和生長主要與孕激素核內受體發揮的基因組作用有關，而越來越多的研究［1］表明孕激素還可以通過核外孕激素受體(progesterone receptor，PR)發揮快速的非基因組作用。PR-M 是2003年發現的定位于線粒體外膜的PR［2］，它在孕激素誘導下使得線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)增加，從而抑制原代培養、永生化子宮平滑肌細胞和乳癌細胞的凋亡［3-4］。研究［5］表明PR-M 的分布與線粒體有關，在子宮平滑肌、心臟和肝臟中均高表達。porin蛋白是參與形成線粒體外膜小孔的線粒體標志性蛋白，調節能量代謝和細胞凋亡［6-7］。作者采用RTPCR 方法分別檢測PR-M 和porin mRNA 在子宮平滑肌瘤及肌瘤旁正常平滑肌組織中的表達情況，同時檢測相應標本中傳統孕激素受體PR-A、PR-B mRNA 的表達，分析3 種PR 與porin 表達的相關性，探討其參與子宮平滑肌瘤發生發展的機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年10月至12月于鄭州大學第三附屬醫院婦產科因子宮平滑肌瘤行子宮切除術的患者28例，年齡39～57(45.8±3.9)歲。患者均無其他合并癥，術前至少半年未服用類固醇激素，通過末次月經時間和病理證實患者子宮內膜均處于增殖期。術中取平滑肌瘤組織標本為研究組，取相應瘤旁正常子宮平滑肌組織為對照組。標本均經病理證實，該研究獲得患者知情同意。

1.2 PR 和porin mRNA 的檢測 采用RT-PCR 方法。取新鮮離體組織1 g，－80℃低溫凍存。Trizol試劑盒、逆轉錄酶、Taq 酶、dNTP 及分子量標準均購自北京全式金生物技術有限公司;PR-A、PR-B、PR-M和線粒體porin RT-PCR 引物由鄭州寶科生物科技公司合成，引物序列見表1。首先提取總RNA 并逆轉錄，然后進行PCR。擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環;72℃延伸10 min。產物采用20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后顯色，以目的基因與內參β-actin 灰度值比值作為目的基因的相對表達水平。

表1 引物序列

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0 對數據進行統計分析。2組PR-M、PR-A、PR-B 與porin mRNA 表達水平的比較采用配對t 檢驗。PR-M、PR-A、PR-B與porin mRNA 表達水平之間的關系采用Pearson 積差相關分析評價，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組PR-M、PR-A、PR-B 和porin mRNA 表達的比較 見圖1和表2。

圖1 對照組(1)和研究組(2)PR-A、PR-B、PR-M 和porin mRNA 的表達

表2 2組PR-M、PR-A、PR-B 和porin mRNA 表達水平的比較

2.2 相關性分析 見表3。研究組PR-M 與porin mRNA 的表達呈正相關。

表3 PR-M、PR-A、PR-B 與porin mRNA 相關性分析結果

3 討論

3.1 PR-M 在子宮平滑肌瘤組織中的表達 PR 屬于配體激活核轉錄因子超家族成員，傳統PR 主要指PR-A 和PR-B，分布于胞核和胞漿。近些年來發現了一些新型PR，如PR-C、PR-M 和PR-T 等。PRM 是2002年從人主動脈細胞和脂肪組織cDNA 文庫中克隆到的定位于線粒體外膜的PR，含有314 個氨基酸，cDNA 約為2 230 bp。同PR-A 和PR-B 相比，PR-M 含有激素結合結構域和鉸鏈區，缺乏氨基末端A/B 結合域、DNA 結合結構域和核定位信號區，所以是一種截短的PR。PR-M 氨基末端的16 個氨基酸構成序列中包含的線粒體定位序列與其獨特的線粒體定位功能有關。已有研究［3］表明PR-M 在人子宮平滑肌瘤和正常子宮平滑肌中均有表達，并且子宮平滑肌瘤組織中表達高于正常子宮平滑肌。該研究結果顯示，人子宮平滑肌瘤和瘤旁正常子宮平滑肌組織中均存在PR-M mRNA，并且子宮平滑肌瘤組織中的表達高于正常子宮平滑肌組織，表明PR-M 在子宮平滑肌瘤生長過程中發揮促進作用。子宮平滑肌瘤組織中PR-A 和PR-B mRNA 表達較高，與報道［8］相一致，再次證實孕激素可以通過基因組效應在肌瘤組織中發揮作用。

3.2 線粒體外膜孔蛋白porin mRNA 的表達 線粒體外膜孔蛋白porin 也稱電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channels，VDAC)，是形成線粒體外膜小孔的主要蛋白成分［6］。VDAC 通過調節線粒體和胞漿之間的離子交換，參與腫瘤、心臟病和神經變性疾病等多種疾病的發生［9］，可作為線粒體外膜的標志蛋白［10］。該研究結果表明，porin mRNA 在子宮平滑肌瘤組織中的表達明顯高于瘤旁正常子宮平滑肌組織，提示肌瘤組織細胞線粒體功能較鄰近平滑肌組織活躍。

3.3 子宮平滑肌瘤中3 種PR 和porin mRNA 的關系 采用孕激素或者PR 激動劑R5020 分別處理MCF-10A 細胞(缺乏核PR 表達的良性乳腺細胞，表達PR-M)和人永生化子宮平滑肌細胞，發現細胞MMP 增加，與細胞內ATP 水平增高一致，這種作用可以被PR 拮抗劑抑制，卻不受基因轉錄抑制劑放線銅菌的影響［3-4］，提示孕激素通過PR-M 非基因組作用增加能量代謝。另外有證據［11］表明PR-B 可以通過非基因組作用介導Src 激酶的活化，激活MAPK 途徑，進而誘導生物學效應。該研究結果顯示，子宮平滑肌瘤組織中PR-M 與porin mRNA 表達水平呈正相關，PR-A、PR-B 與porin mRNA 無相關性。另外，曾有研究［3］從蛋白水平上證實子宮平滑肌瘤組織中PR-M 與porin 表達呈正相關。由此推斷PR-M 在平滑肌瘤組織中的表達升高可能與線粒體外膜功能活躍有關，PR-M 可能通過非基因組作用影響線粒體外膜功能，加強細胞呼吸并抑制線粒體途徑調節的細胞凋亡，從而參與子宮平滑肌瘤的發生發展。

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