環境因子對豆腐特定腐敗菌消長特性的影響

范文教 孫俊秀 陳云川 易宇文 刁 潘

（1.四川旅游學院食品科學系，四川 成都 610100；2.四川大學化學工程學院，四川 成都 610065）

豆腐含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素B1、B2和微量元素等營養物質［1］。因其營養豐富、水分含量高，給微生物的生長繁殖創造良好條件，引起吲哚、硫化氫、有機酸等一系列腐敗代謝產物的積累，從而造成豆腐腐敗變質，可以說豆腐腐敗主要是微生物活動的結果［2］。在大多數情況下，豆腐中所含微生物中只有部分微生物參與這個腐敗變質過程，這些在豆腐腐敗變質中快速生長繁殖并產生腐敗代謝產物的微生物，就是豆腐的特定腐敗菌［3］。由于豆腐的特定腐敗菌與豆腐品質和貨架期之間存在密切關系，在實際生產過程中往往可以通過控制特定腐敗菌生長繁殖來改善產品品質，延長產品貨架期。因此，研究不同環境因子對這些特定腐敗菌的消長特性并揭示其間的內在聯系，是建立豆腐制品品質安全控制措施的基礎和關鍵。

食品的防腐技術主要核心是基于阻止殘留的腐敗菌和致病菌的生長繁殖。在實際生產過程中將不同防腐技術的原理歸結于少數幾個因子，然后針對這些因子的防腐特性，綜合研究抑制引起食品腐敗的微生物的措施，并形成對特定腐敗微生物的多樣化協同，達到強化防腐保鮮的作用［4］。盡管目前對豆腐中特定腐敗菌堅強芽孢桿菌的形態特性以及生化信息表達有所研究，但對其消長特性規律特別是在特定環境下的因子對消長特性規律的影響還鮮有報道。例如李博等［3］以天然豆漿為培養基，研究GDL豆腐中堅強芽孢桿菌的生長曲線，初步確定其生長曲線的初級模型，但研究并未涉及環境因子對堅強芽孢桿菌消長特性的影響。本研究擬以豆腐中分離純化得到的特定腐敗菌（堅強芽孢桿菌）為研究對象，考察加熱強度、pH、鈣離子濃度以及水分活度等環境因子對其消長特性的影響，旨在為研究豆腐制品生產和貯運過程中特定腐敗菌的控制技術提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：由南豆腐（購于成都市光榮豆制品廠）中分離得到的特定腐敗菌堅強芽孢桿菌；

營養肉湯：生化試劑，市售；

豆漿培養基：豆漿樣品于121℃滅菌20min，低溫儲藏備用；

豆腐培養基：豆腐樣品碾碎后于121℃滅菌20min，低溫儲藏備用。

1.2 試驗儀器

無菌操作臺：SW-CJ-1BU型，蘇州博蘭特實驗室系統工程有限公司；

電熱恒溫培養箱：KXB-11A型，上海儀器廠；

數顯恒溫水浴鍋：ZC-18型，中山市遠禾電器公司；

數字式移液槍：DP64528型，美國Dragon公司。

1.3 菌種活化

將堅強芽孢桿菌接種于無菌營養肉湯上，于37℃培養24h后，60℃水浴30min將菌種活化，然后根據試驗需求做成適宜的稀釋度。

1.4 試驗設計

1.4.1 熱處理強度對堅強芽孢桿菌的影響 取1mL活化菌懸液接種于裝有9mL豆漿培養基的試管中，振蕩均勻后于水浴中進行不同強度熱處理，每隔5～30min取樣，迅速冷卻后進行平板菌落計數。試驗中以豆漿培養基作為空白對照。

1.4.2 鈣離子濃度對堅強芽孢桿菌的影響 取1mL活化菌懸液接種于裝有9mL不同鈣離子濃度豆漿培養基的試管中，振蕩均勻后于92℃水浴中處理20min，迅速冷卻后進行平板菌落計數。試驗中以空白豆漿培養基作為空白對照。

1.4.3 pH值對堅強芽孢桿菌的影響 取1mL活化菌懸液接種于裝有9mL不同pH豆漿培養基的試管中，振蕩均勻后于92℃水浴中處理20min，迅速冷卻后進行平板菌落計數。試驗中以空白豆漿培養基作為空白對照。

1.4.4 水分活度對堅強芽孢桿菌的影響 取1mL活化菌懸液接種于裝有10g豆腐培養基的試管中，滴入不同量的豆漿培養基，振蕩均勻后于92℃水浴中處理20min，迅速冷卻后進行平板菌落計數。試驗中以豆腐培養基作為空白對照。

1.5 數據處理

試驗數據用originlab 8.6統計分析軟件進行方差分析和Duncan多重檢驗法來檢驗平均值間的差異顯著性，并作圖。

2 結果與分析

2.1 熱處理強度對堅強芽孢桿菌消長特性的影響

溫度是影響微生物生長的最重要的因素之一。在豆腐生產過程中，高強度的熱處理工序主要有煮漿和保溫成型［5］。由圖1可知，同一熱處理強度下，堅強芽孢桿菌的殘存菌數隨著處理時間的增加而呈遞減趨勢；同一處理時間下，堅強芽孢桿菌的殘存菌數隨著熱處理強度的增加也呈遞減趨勢。從殘存菌數的遞減幅度上分析，當熱處理強度為9 0℃時，殘存菌數下降的幅度最緩慢，在100min內菌體總數降低仍未達到一個數量級；而熱處理強度為92，94，96，9 8℃時，殘存菌體總數下降約一個數量級的時間分別為70，45，20，10min。結果表明，一定熱處理強度對堅強芽孢桿菌的消長特性有顯著影響，特別是在熱處理強度在96℃以上，即使熱處理時間不長，堅強芽孢桿菌殘存菌數也很低。

圖1 不同熱處理強度對堅強芽孢桿菌消長特性的影響Figure 1 Effects of different heat treatment intensity on growth characteristics of Bacillus firmus

2.2 鈣離子濃度對堅強芽孢桿菌消長特性的影響

圖2 鈣離子濃度對堅強芽孢桿菌消長特性的影響Figure 2 Effects of different concentration of Ca2＋on growth characteristics of Bacillus firmus

豆腐生產過程中的點漿就是加入凝固劑成型的過程，常用的凝固劑有石膏、鹽鹵以及葡萄糖酸－δ－內酯等，相應生產的豆腐為嫩豆腐（南豆腐）、老豆腐（北豆腐）、內酯豆腐［6］。本試驗根據所加入的凝固劑石膏，來分析不同鈣離子濃度對堅強芽孢桿菌消長特性的影響。由圖2可知：鈣離子濃度在0～2.0%（m/V）范圍時，堅強芽孢桿菌殘存菌數變化不明顯，在熱處理過程中鈣離子濃度對堅強芽孢桿菌的消長特性不顯著。Jiang-Gong等［7］在研究不同凝固劑對豆腐品質的影響中認為：鈣或鈉離子對豆腐特定腐敗菌的消亡影響不大。在煮漿過程中，鈣或鈉鹽類的存在會增加豆漿的飽和度，降低豆腐成型后的水分活度，從而增加堅強芽孢桿菌的耐熱性；此外，豆漿中鈣或鈉離子強度的增加會提高整個環境的水分活度，促使堅強芽孢桿菌熱敏性的增加。這與Laroche等［8］研究認為鹽類對微生物耐熱性的影響具有多樣性相符。不同梯度鈣離子濃度的堅強芽孢桿菌殘存菌數不同，其原因主要是因為硫酸鈣在充當凝固劑時，點漿成型后豆腐水分活性或點漿過程所需時間的差異造成的；此外，部分差異也可能由平板計數的誤差帶來的。

2.3 pH值對堅強芽孢桿菌消長特性的影響

一般來說，微生物的生長pH值范圍極廣，但是絕大多數種類都生活在pH 5.0～9.0［9］。由圖3可知，以pH 6.6為臨界點，隨著pH值的增加或降低，堅強芽孢桿菌菌體的殘存菌數明顯減少。說明在熱處理過程中pH對堅強芽孢桿菌消長規律影響顯著。有研究［10］表明酸堿度對微生物消亡特性的影響，主要表現在影響微生物細胞自身細胞膜表面電荷的性質及膜的通透性，或者改變整個培養基中營養物質的離子化程度，影響營養物質的吸收平衡，或者徹底改變細胞本身的酶促反應速率及代謝途徑。

圖3 pH值對堅強芽孢桿菌消長特性的影響Figure 3 Effects of different pH on growth characteristics of Bacillus firmus

2.4 水分活度對堅強芽孢桿菌消長特性的影響

微生物生長都需要一定的水分。研究［11］表明：特定微生物的生長局限于所在介質的水分活度。一般來說，只有當環境中的水分活度大于某一臨界值時，微生物才能正常的生長繁殖。

由圖4可知：隨著水分含量的增加，堅強芽孢桿菌菌體的殘存菌數也呈增加趨勢，但增量不明顯，表明在熱處理過程中不同水分活度對堅強芽孢桿菌消長特性有一定影響。

3 結論

圖4 水分活度對堅強芽孢桿菌消長特性的影響Figure 4 Effects of different moisture content on growth characteristics of Bacillus firmus

環境因子對豆腐特定腐敗菌堅強芽孢桿菌的消長特性具有不同程度的影響。本研究通過試驗分析了加熱強度、pH、鈣離子濃度、水分活度這4個環境因子對豆腐特定腐敗菌堅強芽孢桿菌消長特性的影響。結果表明，熱處理強度和pH對堅強芽孢桿菌消長規律影響顯著，水分活度對堅強芽孢桿菌消長規律有一定的影響，鈣離子濃度的影響不顯著。因此，在保證豆腐品質的條件下，這些環境因子對豆腐特定腐敗菌消長特性，可為豆腐制品生產和貯運過程中特定腐敗菌的控制技術提供參考數據。

1 李曉東.功能性大豆食品［M］.北京：化學工業出版社，2006.

2 李除夕，董明盛，陳曉紅，等.豆腐中庫特氏菌生長動力學模型和貨架期預測［J］.農業工程學報，2009，25（Supp.1）：82.

3 李博.GDL豆腐中主要腐敗菌的研究及HACCP的建立［D］.北京：中國農業大學，2002.

4 張佳敏，王衛，唐仁勇.泡椒鳳爪防腐保藏及柵欄因子調控研究［J］.食品工業科技，2014，32（2）：291～295.

5 盧義伯，潘超，祝義亮.豆腐生產中不同制漿工藝研究［J］.食品工業科技，2007，28（8）：182～184.

6 中國國家標準化管理委員會.GB/T 22106—2008 非發酵豆制品［S］.北京：中國標準出版社，2009.

7 Jiang-Gong Liu，Tser-Sheng Lin，Wun-Yuan Lin.Evaluating the growth of Listeria monocytogenes that has been inoculated into tofu containing background microflora［J］.Food Control，2010，21（12）：1 764～1 768.

8 C Laroche，F Fine，P Gervais.Water activity affects heat resistance of microorganisms in food powders［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，97（3）：307～315.

9 李宗軍.壓力 溫度處理對肉制品中微生物的影響［J］.食品與機械，2006，22（3）：14～16.

10 M C Rojo，F N Arroyo López，M C Lerena，et al.Effects of pH and sugar concentration in Zygosaccharomyces rouxii growth and time for spoilage in concentrated grape juice at isothermal and non-isothermal conditions［J］.Food Microbiology，2014，38（3）：143～150.

11 曾鋒，張立彥，曾慶孝.微生物對食品防腐劑的抗藥性研究進展［J］.食品與機械，2005，21（2）：51～53.