灰樹花漆酶的雙水相萃取及酶學性質

虞鳳慧 徐澤平，2 劉圣鵬 馮文娟

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱 州 256500；2.濱州市環境微生物技術工程研究中心，山東 濱 州 256500）

雙水相萃取（aqueous two-phase extraction，ATPS）是近年來發展起來的一種分離提取技術，廣泛應用于蛋白質［1］、酶等生物活性物質的分離、提取和純化。該技術具有操作條件溫和、容易放大、可連續操作［2］，且無有機溶劑殘留等優點［3，4］。更重要的是雙水相萃取避免了傳統液—液萃取中生物活性物質與有機溶劑的直接接觸，保護了其活性［5］，有研究［6］表明聚合物對顆粒或生物分子的結構不但沒有破壞作用，反而有穩定作用。ATPS極具大規模應用的潛力。

漆酶（laccase，EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶［7，8］，具有獨特的催化特性。在污水處理、食品加工、紙漿造紙、紡織等工業［9，10］以及有機合成等化學反應中具有巨大的應用前景，因此，隨著對其研究的逐漸深入，已成為當今的熱門研究課題之一［11］。漆酶廣泛分布于植物、真菌、少數昆蟲和細菌中［12，13］。在真菌中，擔子菌是目前獲得漆酶的主要來源。灰樹花（Grifolafrondosa）屬擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、樹花菌屬［14］，是一種藥食兩用珍稀菇類。灰樹花能分泌多種具有生物活性的代謝產物［15］，一直以來，對它的研究多集中于灰樹花多糖，而對灰樹花漆酶的研究尚不多見。目前，灰樹花漆酶的生產技術極不成熟，產品鮮有報道，主要是因為其酶活力通常很低，更重要的是提取、分離、精制效率低、酶易失活，這些問題亟待解決。傳統方法，如鹽析、微濾、超濾、離子交換層析等方法純化漆酶，一般回收率低。與傳統方法相比，ATPS法簡單易行，易于除去雜質，提高酶的純度且回收率高，有較大的工業應用潛力［16］。本試驗選擇PEG6000/（NH4）2SO4雙水相體系對灰樹花漆酶進行萃取分離效果的研究，同時對純化后的灰樹花漆酶進行酶學性質的研究。為灰樹花漆酶的大規模生產、分離提取及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

灰樹花（Grifolafrondosa）GF-931菌株：本實驗室保存。

1.1.2 培養基

種子培養基：土豆1%，麩皮2%，葡萄糖2%，玉米粉0.5%，蛋白胨 0.3%，酵母浸粉 0.15%，磷酸二 氫鉀 0.05%，硫酸鎂0.1%；

液體發酵培養基：土豆15%，可溶性淀粉1.5%，酵母浸粉0.3%，硫酸銨0.1%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0.1%，硫酸銅0.012%。

1.1.3 主要試劑

2，2-聯氮－二（3-乙基－苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：分析純，美國Sigma公司；

聚乙二醇（PEG）6000：化學純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

硫酸銨：分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；

冰醋酸：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；醋酸鈉：分析純，天津市博迪化工股份有限公司。

1.1.4 儀器

低速大容量離心機：DL-5型，上海安亭科學儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV-1700型，島津（蘇州）有限公司；

精密pH計：PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-1型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

電子天平：FA2004型，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 灰樹花漆酶粗酶液的制備

（1）種子培養：無菌條件下，取適量新鮮的PDA斜面保藏菌種接入種子培養基中，于28℃、200r/min條件下培養2 d，即為一級種子液。

無菌條件下，將適量一級種子液轉接至種子培養基中，于28℃、200r/min條件下培養2d，即為二級種子液。

（2）液體發酵培養：無菌條件下，按10%的接種量，將二級種子液轉接至發酵培養基中，于28℃、200r/min條件下培養8d，發酵液經4 000r/min離心10min，收集上清液，即為漆酶粗酶液，4℃保存備用。

1.2.2 雙水相體系相圖的繪制 精確配制40%（m/V）的（NH4）2SO4和80%PEG6000溶液。取一定量已配制好的PEG6000于一潔凈試管中，加入0.5mL蒸餾水，緩慢滴加已配制好的（NH4）2SO4溶液，混勻，至試管內溶液開始出現混濁為止，記錄加入（NH4）2SO4的體積和質量。然后計量加入適量蒸餾水，使體系澄清，繼續向試管中滴加（NH4）2SO4溶液，使其再次達到混濁，如此反復操作。計算每次達到混濁時PEG6000和（NH4）2SO4在系統總量中的質量分數。以PEG6000的質量分數為縱坐標，（NH4）2SO4的質量分數為橫坐標作圖，即得到一條雙節線［17］。

1.2.3 雙水相萃取方法 根據雙水相體系相圖，選擇可形成雙水相的PEG6000與（NH4）2SO4的濃度。固定體系總質量為20g，向其中加入一定量的PEG6000、（NH4）2SO4溶液至所需質量分數，不足部分以蒸餾水補充，振蕩混勻。然后向雙水相體系中加入酶液至所需質量分數，振蕩混勻2min。4 000r/min離心1 0min使快速分相。讀取上、下相體積及測定酶活，按式（1）～（3）計算相體積比、酶分配系數和酶活收率。

式中：

R——相體積比；

V上——上相體積，mL；

V下——下相體積，mL。

式中：

K——酶分配系數；

U上——上相酶活，U/mL；

U下——下相酶活，U/mL。

式中：

Y——酶活收率，%；

R——相體積比；

K——酶分配系數。

1.2.4 雙水相萃取條件的優化

（1）酶液添加量對漆酶萃取效應的影響：根據雙水相體系相圖，將質量分數為50%的PEG6000和質量分數為40%的（NH4）2SO4溶液配制成可形成雙水相的濃度，按不同的添加量分別加入漆酶粗酶液，組成不同的雙水相體系，進行酶液添加量對漆酶萃取效應影響的研究。

（2）PEG 6000質量分數對漆酶萃取效應的影響：以酶液的最佳添加量為基礎，將質量分數為40%的（NH4）2SO4和質量分數為50%的PEG6000溶液配制成一系列含不同質量分數PEG的雙水相體系，研究PEG6000質量分數對漆酶萃取效應的影響。

（3）（NH4）2SO4質量分數對漆酶萃取效應的影響：以酶液的最佳添加量、PEG6000最佳質量分數為基礎，將質量分數為50%的PEG6000和質量分數為40%的（NH4）2SO4溶液形成一系列含不同質量分數（NH4）2SO4的雙水相體系，研究（NH4）2SO4質量分數對漆酶萃取效應的影響。

（4）雙水相體系pH對漆酶萃取效應的影響：以酶液的最佳添加量、PEG6000最佳質量分數、（NH4）2SO4最佳質量分數為基礎，調節雙水相體系pH 分別為3.5，4.5，5.0，5.5，6.0（自然），研究體系pH對漆酶萃取效應的影響。

（5）正交試驗：根據單因素試驗結果，選擇影響漆酶萃取效應的主要因素，設計正交試驗，確定最佳萃取條件。

1.2.5 漆酶酶活的測定 參照文獻［18］，修改如下：將漆酶酶液用0.05mol/L、pH 5的醋酸—醋酸鈉緩沖液稀釋至適當倍數，于30℃水浴鍋中保溫7min，取2.3mL稀釋酶液于比色皿中，再加入0.7mL 1mM ABTS溶液，兩者迅速混勻，啟動反應。于420nm下測定反應液前2min內吸光值的變化△A，按式（4）計算酶活。酶活定義為每秒鐘氧化1 nmol ABTS所需要的酶量為一個活力單位U。

式中：

XL——酶活，U/mL；

△A——2min內吸光度的變化；

V1——總反應體積，3mL；

ε——ABTS吸光系數，0.036mL/（nmol/cm）；△T——反應時間，120s；

V2——酶液體積，2.3mL；

I——光程，1cm；

n——稀釋倍數。

1.2.6 漆酶的酶學性質研究

（1）漆酶的最適反應溫度：經雙水相萃取純化后，按照1.2.5方法測定純化漆酶酶活。設定漆酶的不同反應溫度為30，35，45，55，65，75，100 ℃，以 測 定 的 最 高 酶 活 力 作 為100%，計算其他不同溫度下漆酶的相對酶活。

（2）漆酶的熱穩定性：設定漆酶的保溫溫度分別為30，35，45，55，65，75，100℃，分別保溫2h，按照1.2.5方法測定純化漆酶剩余酶活力，以最高酶活力作為100%，計算不同溫度下漆酶剩余酶活力的相對酶活。

（3）漆酶的最適反應pH：用0.05mol/L醋酸和醋酸鈉溶液分別配制成pH 2.97，3.50，4.00，4.50，5.00，5.50，6.00，7.00的緩沖液，并以此不同pH梯度的緩沖液分別稀釋漆酶酶液以及配制相應的1mM ABTS底物。在最適反應溫度下，按照1.2.5方法測定純化漆酶酶活，以最高酶活力作為100%，計算不同pH下漆酶的相對酶活。

（4）漆酶的pH穩定性：用0.05mol/L醋酸和醋酸鈉溶液分別配制成 pH 2.97，3.50，4.00，4.50，5.00，5.50，6.00，7.00的緩沖液，并以此不同pH梯度的緩沖液分別稀釋漆酶酶液以及配制相應的1mM ABTS底物。在最適反應溫度下，分別保溫2h，按照1.2.5方法測定純化漆酶剩余酶活力，以最高酶活力作為100%，計算不同pH下漆酶剩余酶活力的相對酶活。

（5）金屬離子對漆酶酶活性的影響：用0.05mol/L醋酸和醋酸鈉溶液配制最適pH的緩沖液，加入不同的金屬鹽，配制成金屬離子濃度為5mmol/L的緩沖液。在最適溫度和最適pH條件下，按照1.2.5方法測定酶活，以不加入金屬離子的酶活力作為100%，計算加入不同金屬離子的漆酶相對酶活。

2 結果與分析

2.1 PEG6000/（NH4）2SO4體系的相圖

由圖1可知，此雙節線圖即為PEG6000/（NH4）2SO4雙水相體系的相圖。雙節線上的點為臨界區，線的下方為均相區，線的上方為兩相區，即可形成雙水相體系，其中T、B點連線稱為系線，T為上相組成，B為下相組成，由此可得知形成雙水相時PEG6000與（NH4）2SO4質量分數的具體配比關系，以此選擇不同的萃取體系進行漆酶萃取效應的研究。

2.2 酶液添加量對漆酶萃取效應的影響

圖1 PEG6000/（NH4）2SO4雙水相體系相圖Figure 1 The phase diagram of aqueous two-phase system PEG6000/（NH4）2SO4

圖2 酶液添加量對漆酶萃取效應的影響Figure 2 The effect of adding amount of enzyme on extraction of laccase with aqueous two-phase system

由圖2可知，隨著漆酶酶液添加量的增加，相體積比變化不明顯，分配系數和酶活收率呈先增后減的趨勢，當酶液添加量為10%時，分配系數和酶活收率最高，分別為4.4和86.4%，此時漆酶的萃取效果最好。因此，選擇酶液的最佳添加量為10%。

2.3 PEG6000質量分數對漆酶萃取效應的影響

由圖3可知，隨著PEG6000質量分數的增加，相體積比先緩慢增加后趨于平緩，分配系數和酶活收率呈逐漸增大趨勢。PEG6000質量分數為22%時，分配系數和酶活收率最高，分別為13.0和95.3%，即漆酶的萃取效果最好。已有研究［19］表明，當（NH4）2SO4質量分數一定時，隨著 PEG 質量分數的增加，酶的分配系數增加，酶活收率也同時增加，增加PEG相的質量分數對分離是有利的。因此，選擇PEG6000的最佳質量分數為22%。

圖3 PEG6000質量分數對漆酶萃取效應的影響Figure 3 The effect of mass fraction of PEG6000on extraction of laccase with aqueous two-phase system

2.4 （NH4）2SO4質量分數對漆酶萃取效應的影響

由圖4可知，隨著（NH4）2SO4質量分數的增加，相體積比逐漸減小，后趨于平穩，分配系數逐漸增大，而酶活收率呈先減后增趨勢，當（NH4）2SO4質量分數為17%時，酶分配系數和酶活收率最高，分別為5.4和85.5%。因此，選擇（NH4）2SO4的最佳質量分數為17%。

2.5 pH對漆酶萃取效應的影響

圖4 （NH4）2SO4質量分數對漆酶萃取效應的影響Figure 4 The effect of mass fraction of（NH4）2SO4on extraction of laccase with aqueous two-phase system

圖5 pH對漆酶萃取效應的影響Figure 5 The effect of pH on extraction of laccase with aqueous two-phase system

由圖5可知，當調節體系pH為3.5至5.5時，分配系數和酶活收率都很低，而體系pH為6.0（自然）時，分配系數和酶活收率明顯增大，分別為5.5和91.1%，因此選擇雙水相體系最佳pH為自然，即不進行pH調節。

2.6 雙水相萃取體系的正交優化

根據單因素試驗結果，選擇酶液添加量、PEG6000質量分數和（NH4）2SO4質量分數為三因素，按照表1設計L9（33）正交表，正交試驗結果見表2。由表2可知，各因素對PEG6000/（NH4）2SO4體系萃取漆酶的影響主次關系為RA＞RC＞RB，即酶液添加量對萃取效率的影響最大，其次為（NH4）2SO4質量分數和PEG6000質量分數。另外，從極差來看，RD（空列）＞RB，說明試驗中有一定的誤差，是否還有其他因素比PEG6000質量分數對漆酶萃取效果的影響大，有待進一步驗證。最優組合為A1B3C2，即當酶液添加量為5%，PEG6000質量分數為25%，（NH4）2SO4質量分數為17%時，漆酶的萃取效果最佳，并在此最佳萃取條件下進行驗證實驗，得到漆酶的分配系數和酶活收率分別高達7.6和96.6%，說明正交試驗優化出的最佳萃取條件較好。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels for orthogonal design/%

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experimental design

2.7 漆酶的酶學性質研究

2.7.1 漆酶的最適反應溫度 由圖6可知，在45℃時純化漆酶的酶活最高，之后酶活明顯降低，至100℃時酶活幾乎為0。因此，確定純化漆酶的最適反應溫度為45℃。

圖6 漆酶的最適反應溫度Figure 6 The optimal temperature of the purified laccase activity

2.7.2 漆酶的熱穩定性 由圖7可知，在30，35，45℃分別保溫2h后，漆酶的剩余相對酶活分別為78.2%，86.7%，74.4%，穩定性較好，而在55℃保溫2h后其相對酶活仍剩余65.3%，由此表明，純化漆酶在30～55℃范圍內具有一定的穩定性，其中在30～45℃范圍內，熱穩定性較好。

2.7.3 漆酶的最適反應pH 由圖8可知，在最適反應溫度45℃時，反應pH為2.97時漆酶的酶活最高，之后酶活迅速下降，pH為4時相對酶活僅為61.0%，由此確定，在測定條件下，漆酶的最適反應pH為2.97。

圖7 漆酶的熱穩定性Figure 7 The thermostability of the purified laccase activity

2.7.4 漆酶的pH穩定性 由圖9可知，純化漆酶在p H 3.5～5.0時穩定性較好，保溫2h，剩余相對酶活均在72.7%～87.7%，在pH 5.5條件下保溫2h，相對酶活仍為66.0%，之后酶活逐漸降低，pH 7時酶活幾乎為0。由此可知，純化漆酶在pH 3.5～5.0時穩定性最好。

圖8 漆酶的最適反應pHFigure 8 The optimal pH of the purified laccase activity

圖9 漆酶的pH穩定性Figure 9 The purified laccase stability under different pH

2.7.5 金屬離子對漆酶酶活性的影響 由圖10可知，與對照相 比 （不 加 金 屬 離 子），金 屬 離 子 Cu2＋、Zn2＋、Mg2＋、Mn2＋、K＋、Ca2＋對漆酶酶活有較好的促進作用，其中 Cu2＋和Mg2＋促進作用最顯著，其相對酶活分別達150.0%和148.0%。而Co2＋、Fe2＋、Na＋則對漆酶酶活有很大的抑制作用，其中Fe2＋抑制作用最明顯，其相對酶活僅為2.0%。

圖10 金屬離子對漆酶酶活的影響Figure 10 The effects of metal ions on the laccase activity

3 討論

本實驗室通過灰樹花GF-931菌株的液體發酵，灰樹花漆酶的酶活力可達200～300U/mL，直接冷凍干燥酶活達3萬U/g，采用ATPS法對其進行分離純化，顯著降低了酶損失的同時，更提高了其純度，穩定了酶活性。

本試驗采用PEG6000/（NH4）2SO4雙水相體系對灰樹花漆酶進行萃取效應的研究。通過單因素試驗研究酶液添加量、PEG6000質量分數、（NH4）2SO4質量分數和體系pH對灰樹花漆酶萃取效應的影響，通過正交試驗進一步優化萃取條件。試驗結果表明：在pH為6（自然）時，漆酶最佳萃取條件為酶液添加量5%，PEG6000質量分數25%，（NH4）2SO4質量分數17%，在此最佳萃取條件下進行驗證實驗，漆酶的分配系數和酶活收率分別高達7.6和96.6%。說明該技術能夠用于灰樹花漆酶的分離純化。

對雙水相萃取純化的漆酶進行了酶學性質研究，由試驗結果可知，純化漆酶的最適反應溫度為45℃，在30～45℃時熱穩定性最好；最適反應pH為2.97，在pH 3.5～5.0時具有較好的穩定性。金屬離子 Cu2＋、Zn2＋、Mg2＋、Mn2＋、K＋、Ca2＋對漆酶酶活有促進作用，其中Cu2＋和Mg2＋促進作用最強；而Co2＋、Fe2＋、Na＋則抑制漆酶酶活，其中Fe2＋的抑制作用最明顯。

本試驗利用ATPS法進行了灰樹花漆酶的萃取，確定了最佳萃取條件，并進行了純化漆酶的酶學性質研究，為漆酶的系統研究及工業化生產和應用提供了理論依據。

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