從啤酒廢酵母中提取甘露聚糖的工藝條件優化

孔凌云 史詠華 吳 煒 邵 偉

（1.三峽大學生物與制藥學院，湖北 宜昌 443001；2.河南南街村集團技術中心，河南 臨穎 462600）

中國是釀酒大國，其發酵液及其酵母壁原料多，一般用作飼料或廢棄［1］。啤酒廢酵母是提取多種生化物質及生化藥物的寶貴資源［2］。酵母細胞壁主要由β－葡聚糖和甘露聚糖組成，甘露聚糖占酵母細胞壁干重的40%左右［3］。甘露聚糖具有增加動物體液免疫和細胞免疫能力，能調節腸道菌群平衡，選擇性吸附霉菌毒素，具有抗輻射、抗氧化、抗腫瘤，改善血清脂質，降低膽固醇含量，防止便秘，改善多種消化系統疾病等功能，是一種極具市場潛力的食品添加劑［4，5］。甘露聚糖目前在食品工業中作為膠凝劑、增稠劑和保水劑而被廣泛應用［6］。采用全細胞制備酵母多糖的傳統方法具有酸堿用量大、回收成本高，容易破壞多糖結構等缺點［7－10］，不利于工業化大規模生產。目前，以啤酒廢酵母為原料提取甘露聚糖的工藝存在用堿量過多、收率低、成本高等方面的不足。因此，優化與改進現有工藝條件就顯得尤為重要。為此，本研究擬采用正交試驗方法，以甘露聚糖得率為評價指標，以自溶后的酵母細胞壁為原料，優化建立甘露聚糖提取工藝，以期提高提取率、減輕后期的純化壓力，而且降低堿的用量，減少對多糖的降解，使其保持較高生理活性，以期為啤酒廢酵母甘露聚糖的規模化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮啤酒酵母：由河南南街村集團南德啤酒廠提供；甘露糖標準品：純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司；

其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

電子天平：ALC-210.4型，北京賽多利斯儀器系統公司；

pH計：pHS-3C型，上海雷磁儀器廠；

高壓均質機：SRH60-70型，上海申鹿均質機有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-30SII型，上海博迅實業實限有限公司；

離心機：TGL-20LM型，湖南星科科學儀器有限公司；

紫外－可見分光光度計：Varian Cary50型，美國瓦里安技術公司。

1.3 甘露聚糖提取方法

1.3.1 甘露聚糖提取工藝

啤酒廢酵母→預處理→自溶→均質→NaOH提取→脫蛋白→乙醇醇析→乙醚、丙酮洗滌→干燥→成品

1.3.2 操作要點

（1）啤酒廢酵母的預處理：按1∶1（V∶V）的比例將純凈水加入啤酒廢酵母泥中進行洗滌，并經100目篩子過篩，然后以3 000r/min離心10min，如此3次，以除去其中的酒花等雜質［11，12］，收集洗凈的酵母泥。

（2）自溶：稱取一定量的酵母泥，按料水比1∶4（m∶m）的比例加入純凈水，制成酵母懸液，添加適量2%NaCl、p H 4.5的醋酸—醋酸鈉緩沖液，于45～50℃保溫攪拌自溶1 8h。

（3）均質：將自溶液以3 000r/min離心10min，得沉淀物，按料水比1∶3（m∶m）的比例加入純凈水，制成酵母細胞壁懸液，在40MPa條件下進行均質處理（均質進料溫度70℃），再以3 000r/min離心10min，得酵母細胞壁沉淀物。

（4）提取：稱取酵母細胞壁，添加不同質量濃度的NaOH配成不同的料液比，并在不同的溫度及時間下浸提，3 000r/min離心10min取上清液，用20%的醋酸溶液中和至pH 7.0，攪拌10min，離心取上清液。

（5）脫蛋白：將提取后獲得的含甘露聚糖的上清液中加入10%濃度的三氯乙酸溶液，調pH為3，4℃冰箱冷藏靜置過夜，離心脫蛋白。

（6）精制干燥：向脫蛋白后的溶液中加入2倍體積無水乙醇過夜，離心取沉淀物，分別用乙醚、丙酮洗滌，60℃干燥得甘露聚糖成品。

1.4 試驗方法

（1）料液比的影響：取2.5g酵母細胞壁各5份，添加3%的 NaOH分別制成料液比為1∶10，1∶12.5，1∶15，1∶17.5，1∶20（m∶V）的懸浮液于90℃浸提2h，測甘露聚糖含量。

（2）NaOH濃度的影響：取2.5g酵母細胞壁各5份，分別添加濃度為1%，2%，3%，4%，5%的NaOH配成料液比1∶15（m∶V）的懸浮液，90℃浸提2h，測甘露聚糖含量。

（3）浸提時間的影響：取2.5g酵母細胞壁各5份，添加濃度為3%的NaOH制成料液比為1∶15（m∶V）的懸浮液，于90℃分別浸提1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，測甘露聚糖含量。

（4）浸提溫度的影響：取2.5g酵母細胞壁各5份，添加濃度為3%的NaOH配成料液比為1∶15（m∶V）的懸浮液，分別于60，70，80，90，100℃下浸提2h，測甘露聚糖含量。

1.5 測定方法

（1）甘露聚糖含量的測定：參照文獻［13］，以紫外分光光度法進行測定。

（2）樣品處理：稱取20mg左右的酵母甘露聚糖，碾磨溶解于2.5mL 72%H2SO4中，室溫放置3h，加蒸餾水使硫酸的最終濃度為4mol/L左右，然后100℃酸水解4h，取出冷卻至室溫，用 NaOH調pH至中性，再用0.2mol/L p H 7.0磷酸緩沖液定容至100mL。

（3）標準曲線的制作：參照文獻［13］的方法繪制標準曲線。

（4）樣品甘露聚糖濃度的測定：吸取0.2mL樣液，參照文獻［13］的方法于280nm測吸光值，求得△OD，以標準曲線計算甘露糖濃度，從而得出甘露聚糖濃度。

（5）甘露聚糖提取率的計算：

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

以甘露糖為標準樣品，紫外分光光度法測定其吸光度，繪制的甘露糖標準曲線見圖1。

圖1 甘露糖標準曲線Figure 1 Standard curve of mannose

標準曲線方程為y＝0.001 5x－0.027 07（y為△OD，x為甘露糖質量濃度μg/mL），相關系數R2＝0.996 3。

2.2 料液比對甘露聚糖提取率的影響

圖2 料液比對甘露聚糖提取率的影響Figure 2 Effects of different solid-liquid ratio on the extraction rate of mannan

由圖2可知，當料液比小于1∶15（m∶V）時，甘露聚糖提取率隨料液比的增加而增加；當料液比為1∶15（m∶V）時，甘露聚糖提取率最大，說明在料液比較低時，提取液尚未充分發揮作用，堿提不徹底；料液比高于1∶15（m∶V）時，提取液不足，影響提取效果。因此，以1∶15（m∶V）為提取甘露聚糖的較佳料液比。

2.3 NaOH濃度對甘露聚糖提取率的影響

由圖3可知，當NaOH添加量小于2%時，由于堿的水解，使可溶性的甘露聚糖溶出，低濃度堿對甘露聚糖的提取具有促進作用；當NaOH添加量大于2%時，提取出的甘露聚糖被高濃度的堿降解，而且堿濃度越大對甘露聚糖的破壞越厲害，損失也越大。故選擇質量濃度2%的NaOH作為提取啤酒廢酵母甘露聚糖的添加量。

圖3 NaOH濃度對甘露聚糖提取率的影響Figure 3 Effects of different concentration of NaOH on the extraction rate of mannan

2.4 浸提時間對甘露聚糖提取率的影響

由圖4可知，浸提時間小于1.5h時，NaOH發揮水解作用，使細胞壁上的甘露聚糖溶出，但由于時間較短，提取尚未結束，所以呈現上升趨勢；當浸提時間大于1.5h時，隨著堿提時間的延長，甘露聚糖降解，提取率降低。因此，選擇1.5h作為提取甘露聚糖的浸提時間。

2.5 浸提溫度對甘露聚糖提取率的影響

由圖5可知，浸提溫度不同，甘露聚糖提取率也不同。當溫度低于90℃時，甘露聚糖提取率隨溫度的升高呈上升趨勢，說明在溫度比較低的時候反應不徹底，堿提不充分；溫度高于9 0℃時，隨著溫度的繼續升高，堿提過程中溶出的甘露聚糖又會被降解，破壞多糖結構，使提取率呈現下降趨勢。因此，選擇9 0℃為提取甘露聚糖的浸提溫度。

圖4 浸提時間對甘露聚糖提取率的影響Figure 4 Effects of different time on the extraction rate of mannan

圖5 浸提溫度對甘露聚糖提取率的影響Figure 5 Effects of different rate of mannan

2.6 甘露聚糖提取工藝條件的優化

根據單因素試驗結果，選擇料液比、NaOH濃度、浸提時間、浸提溫度等因素進行考察，并以甘露聚糖提取率為考察指標，建立正交試驗因素水平表見表1，正交試驗結果與分析見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The design of the head of table L9（34）

表2 L9（34）正交試驗結果與分析Table 2 L9（34）orthogonal array design arrangement and experimental results

由表2可知，影響甘露聚糖提取效果因素的主次順序為：D＞A＞C＞B，通過極差分析可以確定甘露聚糖提取工藝的最佳條件為 A3B2C1D3，即料液比為1∶17.5（m∶V），NaOH濃度為2%，浸提時間為1.0h，浸提溫度為9 0℃。

對試驗結果進行方差分析，結果見表3。

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variances for extraction yield of polysaccharides with various extraction conditions

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variances for extraction yield of polysaccharides with various extraction conditions

＊ 差異顯著（P＜0.05）。

來源 偏差平方和 自由度 F比 顯著性（α＝0.05）A 24.084 2 0.973＊ 99.02 8 B 10.071 2 0.407 C 22.260 2 0.899 ＊D 42.605 2 1.721 ＊誤差

由表3可知，因素A、C和D在P＜0.05的水平上有顯著性差異，因素B不顯著。

2.7 最佳提取條件的驗證

根據確定的甘露聚糖提取最佳工藝條件，對啤酒廢酵母進行甘露聚糖提取，做3次平行提取實驗，并對所提取的甘露聚糖進行含量測定，其甘露聚糖平均提取率可達到1 8.15%，低于表2中試驗8的18.88%的提取率，說明試驗中存在一定的試驗誤差、各因素間存在交互作用。

3 結論

本研究以啤酒廢酵母為原料，通過單因素試驗，考察了不同料液比、NaOH濃度、浸提時間、浸提溫度對酵母甘露聚糖提取效果的影響，并在此基礎上進行了L9（34）正交試驗，確定的最優工藝參數為料液比1∶17.5（m∶V），NaOH濃度2%，浸提時間1.0h，浸提溫度90℃。在此條件下制備甘露聚糖，所得甘露聚糖平均提取率為18.15%。由此可見，以自溶后的酵母細胞壁為試材提取甘露聚糖，不僅操作簡單、經濟廉價，而且減少了堿的用量，提高了提取率，這與梁新樂等［5］使用濃度6%的NaOH，甘露聚糖提取率6.63%相比，堿用量降低了4%，而提取率提高了3倍左右；與朱紅蕾等［8］使用濃度5%的NaOH，甘露聚糖提取率4.4%相比，堿用量降低了3%，提取率提高了4倍左右。該方法在操作上減少了堿的用量，提高了啤酒廢酵母甘露聚糖的提取率，可做為工業化生產酵母甘露聚糖的技術參考。

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