12份櫻桃品種遺傳多樣性的ISSR分析

陳新+張慶霞+徐麗+賈建云+王甲威+劉慶忠

摘 要：本試驗采用ISSR技術對12份櫻桃種質資源的遺傳多樣性進行了研究。篩選出6條ISSR引物對供試材料進行擴增，共檢測到48個遺傳位點，包含44個多態性位點，多態性位點百分率為91.67%。材料間遺傳相似系數為0.29～0.98，平均為0.65。當閾值為0.58時，供試樣品可分為3個組，即組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ。遺傳相似性分析結果顯示材料間具有豐富的遺傳多樣性。

關鍵詞：櫻桃；遺傳多樣性；ISSR

中圖分類號：S662.501 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0012-03

櫻桃為薔薇科（Rosacea）李屬（Prunus）櫻桃組植物，多分布在亞洲和歐洲[1]，全世界櫻桃組植物約有120種以上，主要分布于北半球溫和地帶。中國栽培櫻桃已有3000多年的歷史。我國栽培的櫻桃可分為四大類，即中國櫻桃、甜櫻桃、酸櫻桃和毛櫻桃[2]，其中以中國櫻桃和甜櫻桃為主要栽培對象。我國櫻桃種質資源豐富，華北、華中及兩廣地區皆有分布，尤以浙江、山東、河南、江蘇、陜西、四川、安徽、河北分布最多，為充分挖掘櫻桃種質資源提供了天然條件[3，4]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat） 是Zietkiewitcz等于1994年發展起來的微衛星基礎上的分子標記[5]，是一種簡單重復序列之間擴增多態性分子標記。其利用基因組中有關SSR序列信息，引物的開發較SSR引物簡單，且可以在不同的物種間通用，不像SSR標記一樣具有較強的種屬特異性。ISSR分子標記不僅具有SSR標記的穩定性且揭示的多態性較RAPD高[6，7]，是一種非常理想的分子標記技術，目前已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳作圖、遺傳多樣性及分子生態學研究。本試驗采用ISSR標記技術對山東省部分主栽櫻桃品種和砧木資源進行檢測，并分析其遺傳背景差異，對櫻桃資源的科研、生產具有重要的實際應用價值和科學價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料均于2014年4月采自山東省果樹研究所櫻桃品種資源保存圃，所用12份材料均為目前生產上的主要栽培品種。隨機采取健康嫩葉迅速于液氮中冷凍，放于-80℃冰箱保存備用。樣品編號及品種見表1。

1.2 模板DNA的制備

采用改良CTAB法[8]提取葉片的基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。稀釋DNA至終濃度10 ng/μL，-20℃儲存備用。

1.3 ISSR反應

ISSR引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成，篩選出6條用于PCR（表2）。PCR擴增體系為20 μL，其中10 × buffer （含Mg2+） 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L Primer 1 μL，2.5 U/μL Taq聚合酶0.4 μL，10 ng/μL DNA模板1 μL 和無菌ddH2O 14 μL。PCR 反應程序為95℃ 5 min；95℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個循環；72℃ 10 min，程序結束后進入4℃保存。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，于紫外燈下觀察，并拍照保存。

1.4 數據統計分析

將所獲得的電泳譜帶進行數字化統計，按照圖譜中同一位置條帶的“有”、“無”進行統計，有帶標記為“1”，無帶標記為“0”，僅記錄重復性好、條帶清晰且片段為200～750 bp 范圍內的擴增帶。將DNA擴增帶數據輸入到數據矩陣，通過NTSYSpc（version 2.11 a）采用非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析建立聚類圖，并計算遺傳相似系數。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物的多態性分析

6條引物均能對12份櫻桃種質基因組DNA擴增出清晰穩定的多態性條帶，圖1為引物ISSR36擴增的帶型。本試驗共檢測到48個遺傳位點，其中包含44個多態性遺傳位點，多態性位點比率為91.67%（表2）。同一樣品的不同引物擴增條帶數量和多態性差異較大。

2.2 遺傳相似性

12份櫻桃種質個體間的相似系數為0.29～0.98，平均值為0.65。其中1與4和2與3的遺傳相似系數最大，為0.98，說明其遺傳距離最近，即親緣關系最近，5與10 的遺傳相似系數最小，僅為0.29，說明二者遺傳相似性最低，親緣關系最遠。

2.3 聚類分析

對供試12份種質進行聚類分析，結果表明，品種間遺傳背景有較大的差異，遺傳多樣性豐富。在相似系數0.58處，12個品種可聚類為3個組（圖2），其中，1、4、10、2、3、11和12聚為一個分支，為組Ⅰ；5和9聚為一個分支，為組Ⅱ；6、7和8聚為一個分支，為組Ⅲ。

3 結論

6條ISSR 引物均能有效擴增出多態性條帶，說明ISSR標記是櫻桃遺傳分析的有效工具。供試12個樣品間的相似系數分布在0.29～0.98之間，ISSR標記能將供試樣品完全區分開。品種間具有豐富的遺傳多樣性，親緣關系復雜，遺傳背景存在很大差異。物種的地理分布特征也可能影響其遺傳多樣性水平，一般而言，廣泛分布比狹域分布的物種具有更高的遺傳多樣性[9]，供試櫻桃品種間表現出較高遺傳多樣性，可能與它們地理分布相對較廣有關。參 考 文 獻：

[1] 俞德浚.中國植物志[M].北京：科學出版社， 1986： 46-87.

[2] 于亞軍，代漢萍，李寶江，等. 世界櫻桃育種進展[J]. 果樹學報，2003，20（2）：135-139.

[3] 胡正剛.中國櫻桃的分布及生產現狀[J].落葉果樹， 1996（3）：29-30.

[4] Li M M，Cai Y L，Qian Z Q， et al. Genetic diversity and differentiation in Chinese sour cherry Prunus pseudocerasus Lindl.， and its implications for conservation[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2009， 56（4）： 455-464.

[5] Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20： 176-183.

[6] Sanchez de la Hoz M P，Davila J A，Loarce Y，et al. Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley [J]. Genome， 1996， 39（1）： 112-117.

[7] Ratnaparkhe M B，Santra D K，Tullu A，et al. Inheritance of inter-simple-sequence-repeat polymorphisms and linkage with a fusarium wilt resistance gene in chickpea [J].Theor. Appl. Genet.， 1998， 96（3/4）： 348-353.

[8] 陳新.榛子花芽轉錄組文庫的Solexa 測序及冷調節基因的表達譜分析[D].北京：中國林業科學研究院，2011.

[9] Nybom H， Bartish I V. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants [J]. Perspectives in Plant Ecology， Evolution and Systematics， 2000， 3（2）：93-114.

摘 要：本試驗采用ISSR技術對12份櫻桃種質資源的遺傳多樣性進行了研究。篩選出6條ISSR引物對供試材料進行擴增，共檢測到48個遺傳位點，包含44個多態性位點，多態性位點百分率為91.67%。材料間遺傳相似系數為0.29～0.98，平均為0.65。當閾值為0.58時，供試樣品可分為3個組，即組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ。遺傳相似性分析結果顯示材料間具有豐富的遺傳多樣性。

關鍵詞：櫻桃；遺傳多樣性；ISSR

中圖分類號：S662.501 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0012-03

櫻桃為薔薇科（Rosacea）李屬（Prunus）櫻桃組植物，多分布在亞洲和歐洲[1]，全世界櫻桃組植物約有120種以上，主要分布于北半球溫和地帶。中國栽培櫻桃已有3000多年的歷史。我國栽培的櫻桃可分為四大類，即中國櫻桃、甜櫻桃、酸櫻桃和毛櫻桃[2]，其中以中國櫻桃和甜櫻桃為主要栽培對象。我國櫻桃種質資源豐富，華北、華中及兩廣地區皆有分布，尤以浙江、山東、河南、江蘇、陜西、四川、安徽、河北分布最多，為充分挖掘櫻桃種質資源提供了天然條件[3，4]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat） 是Zietkiewitcz等于1994年發展起來的微衛星基礎上的分子標記[5]，是一種簡單重復序列之間擴增多態性分子標記。其利用基因組中有關SSR序列信息，引物的開發較SSR引物簡單，且可以在不同的物種間通用，不像SSR標記一樣具有較強的種屬特異性。ISSR分子標記不僅具有SSR標記的穩定性且揭示的多態性較RAPD高[6，7]，是一種非常理想的分子標記技術，目前已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳作圖、遺傳多樣性及分子生態學研究。本試驗采用ISSR標記技術對山東省部分主栽櫻桃品種和砧木資源進行檢測，并分析其遺傳背景差異，對櫻桃資源的科研、生產具有重要的實際應用價值和科學價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料均于2014年4月采自山東省果樹研究所櫻桃品種資源保存圃，所用12份材料均為目前生產上的主要栽培品種。隨機采取健康嫩葉迅速于液氮中冷凍，放于-80℃冰箱保存備用。樣品編號及品種見表1。

1.2 模板DNA的制備

采用改良CTAB法[8]提取葉片的基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。稀釋DNA至終濃度10 ng/μL，-20℃儲存備用。

1.3 ISSR反應

ISSR引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成，篩選出6條用于PCR（表2）。PCR擴增體系為20 μL，其中10 × buffer （含Mg2+） 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L Primer 1 μL，2.5 U/μL Taq聚合酶0.4 μL，10 ng/μL DNA模板1 μL 和無菌ddH2O 14 μL。PCR 反應程序為95℃ 5 min；95℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個循環；72℃ 10 min，程序結束后進入4℃保存。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，于紫外燈下觀察，并拍照保存。

1.4 數據統計分析

將所獲得的電泳譜帶進行數字化統計，按照圖譜中同一位置條帶的“有”、“無”進行統計，有帶標記為“1”，無帶標記為“0”，僅記錄重復性好、條帶清晰且片段為200～750 bp 范圍內的擴增帶。將DNA擴增帶數據輸入到數據矩陣，通過NTSYSpc（version 2.11 a）采用非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析建立聚類圖，并計算遺傳相似系數。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物的多態性分析

6條引物均能對12份櫻桃種質基因組DNA擴增出清晰穩定的多態性條帶，圖1為引物ISSR36擴增的帶型。本試驗共檢測到48個遺傳位點，其中包含44個多態性遺傳位點，多態性位點比率為91.67%（表2）。同一樣品的不同引物擴增條帶數量和多態性差異較大。

2.2 遺傳相似性

12份櫻桃種質個體間的相似系數為0.29～0.98，平均值為0.65。其中1與4和2與3的遺傳相似系數最大，為0.98，說明其遺傳距離最近，即親緣關系最近，5與10 的遺傳相似系數最小，僅為0.29，說明二者遺傳相似性最低，親緣關系最遠。

2.3 聚類分析

對供試12份種質進行聚類分析，結果表明，品種間遺傳背景有較大的差異，遺傳多樣性豐富。在相似系數0.58處，12個品種可聚類為3個組（圖2），其中，1、4、10、2、3、11和12聚為一個分支，為組Ⅰ；5和9聚為一個分支，為組Ⅱ；6、7和8聚為一個分支，為組Ⅲ。

3 結論

6條ISSR 引物均能有效擴增出多態性條帶，說明ISSR標記是櫻桃遺傳分析的有效工具。供試12個樣品間的相似系數分布在0.29～0.98之間，ISSR標記能將供試樣品完全區分開。品種間具有豐富的遺傳多樣性，親緣關系復雜，遺傳背景存在很大差異。物種的地理分布特征也可能影響其遺傳多樣性水平，一般而言，廣泛分布比狹域分布的物種具有更高的遺傳多樣性[9]，供試櫻桃品種間表現出較高遺傳多樣性，可能與它們地理分布相對較廣有關。參 考 文 獻：

[1] 俞德浚.中國植物志[M].北京：科學出版社， 1986： 46-87.

[2] 于亞軍，代漢萍，李寶江，等. 世界櫻桃育種進展[J]. 果樹學報，2003，20（2）：135-139.

[3] 胡正剛.中國櫻桃的分布及生產現狀[J].落葉果樹， 1996（3）：29-30.

[4] Li M M，Cai Y L，Qian Z Q， et al. Genetic diversity and differentiation in Chinese sour cherry Prunus pseudocerasus Lindl.， and its implications for conservation[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2009， 56（4）： 455-464.

[5] Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20： 176-183.

[6] Sanchez de la Hoz M P，Davila J A，Loarce Y，et al. Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley [J]. Genome， 1996， 39（1）： 112-117.

[7] Ratnaparkhe M B，Santra D K，Tullu A，et al. Inheritance of inter-simple-sequence-repeat polymorphisms and linkage with a fusarium wilt resistance gene in chickpea [J].Theor. Appl. Genet.， 1998， 96（3/4）： 348-353.

[8] 陳新.榛子花芽轉錄組文庫的Solexa 測序及冷調節基因的表達譜分析[D].北京：中國林業科學研究院，2011.

[9] Nybom H， Bartish I V. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants [J]. Perspectives in Plant Ecology， Evolution and Systematics， 2000， 3（2）：93-114.

摘 要：本試驗采用ISSR技術對12份櫻桃種質資源的遺傳多樣性進行了研究。篩選出6條ISSR引物對供試材料進行擴增，共檢測到48個遺傳位點，包含44個多態性位點，多態性位點百分率為91.67%。材料間遺傳相似系數為0.29～0.98，平均為0.65。當閾值為0.58時，供試樣品可分為3個組，即組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ。遺傳相似性分析結果顯示材料間具有豐富的遺傳多樣性。

關鍵詞：櫻桃；遺傳多樣性；ISSR

中圖分類號：S662.501 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0012-03

櫻桃為薔薇科（Rosacea）李屬（Prunus）櫻桃組植物，多分布在亞洲和歐洲[1]，全世界櫻桃組植物約有120種以上，主要分布于北半球溫和地帶。中國栽培櫻桃已有3000多年的歷史。我國栽培的櫻桃可分為四大類，即中國櫻桃、甜櫻桃、酸櫻桃和毛櫻桃[2]，其中以中國櫻桃和甜櫻桃為主要栽培對象。我國櫻桃種質資源豐富，華北、華中及兩廣地區皆有分布，尤以浙江、山東、河南、江蘇、陜西、四川、安徽、河北分布最多，為充分挖掘櫻桃種質資源提供了天然條件[3，4]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat） 是Zietkiewitcz等于1994年發展起來的微衛星基礎上的分子標記[5]，是一種簡單重復序列之間擴增多態性分子標記。其利用基因組中有關SSR序列信息，引物的開發較SSR引物簡單，且可以在不同的物種間通用，不像SSR標記一樣具有較強的種屬特異性。ISSR分子標記不僅具有SSR標記的穩定性且揭示的多態性較RAPD高[6，7]，是一種非常理想的分子標記技術，目前已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳作圖、遺傳多樣性及分子生態學研究。本試驗采用ISSR標記技術對山東省部分主栽櫻桃品種和砧木資源進行檢測，并分析其遺傳背景差異，對櫻桃資源的科研、生產具有重要的實際應用價值和科學價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料均于2014年4月采自山東省果樹研究所櫻桃品種資源保存圃，所用12份材料均為目前生產上的主要栽培品種。隨機采取健康嫩葉迅速于液氮中冷凍，放于-80℃冰箱保存備用。樣品編號及品種見表1。

1.2 模板DNA的制備

采用改良CTAB法[8]提取葉片的基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。稀釋DNA至終濃度10 ng/μL，-20℃儲存備用。

1.3 ISSR反應

ISSR引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成，篩選出6條用于PCR（表2）。PCR擴增體系為20 μL，其中10 × buffer （含Mg2+） 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L Primer 1 μL，2.5 U/μL Taq聚合酶0.4 μL，10 ng/μL DNA模板1 μL 和無菌ddH2O 14 μL。PCR 反應程序為95℃ 5 min；95℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個循環；72℃ 10 min，程序結束后進入4℃保存。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，于紫外燈下觀察，并拍照保存。

1.4 數據統計分析

將所獲得的電泳譜帶進行數字化統計，按照圖譜中同一位置條帶的“有”、“無”進行統計，有帶標記為“1”，無帶標記為“0”，僅記錄重復性好、條帶清晰且片段為200～750 bp 范圍內的擴增帶。將DNA擴增帶數據輸入到數據矩陣，通過NTSYSpc（version 2.11 a）采用非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析建立聚類圖，并計算遺傳相似系數。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物的多態性分析

6條引物均能對12份櫻桃種質基因組DNA擴增出清晰穩定的多態性條帶，圖1為引物ISSR36擴增的帶型。本試驗共檢測到48個遺傳位點，其中包含44個多態性遺傳位點，多態性位點比率為91.67%（表2）。同一樣品的不同引物擴增條帶數量和多態性差異較大。

2.2 遺傳相似性

12份櫻桃種質個體間的相似系數為0.29～0.98，平均值為0.65。其中1與4和2與3的遺傳相似系數最大，為0.98，說明其遺傳距離最近，即親緣關系最近，5與10 的遺傳相似系數最小，僅為0.29，說明二者遺傳相似性最低，親緣關系最遠。

2.3 聚類分析

對供試12份種質進行聚類分析，結果表明，品種間遺傳背景有較大的差異，遺傳多樣性豐富。在相似系數0.58處，12個品種可聚類為3個組（圖2），其中，1、4、10、2、3、11和12聚為一個分支，為組Ⅰ；5和9聚為一個分支，為組Ⅱ；6、7和8聚為一個分支，為組Ⅲ。

3 結論

6條ISSR 引物均能有效擴增出多態性條帶，說明ISSR標記是櫻桃遺傳分析的有效工具。供試12個樣品間的相似系數分布在0.29～0.98之間，ISSR標記能將供試樣品完全區分開。品種間具有豐富的遺傳多樣性，親緣關系復雜，遺傳背景存在很大差異。物種的地理分布特征也可能影響其遺傳多樣性水平，一般而言，廣泛分布比狹域分布的物種具有更高的遺傳多樣性[9]，供試櫻桃品種間表現出較高遺傳多樣性，可能與它們地理分布相對較廣有關。參 考 文 獻：

[1] 俞德浚.中國植物志[M].北京：科學出版社， 1986： 46-87.

[2] 于亞軍，代漢萍，李寶江，等. 世界櫻桃育種進展[J]. 果樹學報，2003，20（2）：135-139.

[3] 胡正剛.中國櫻桃的分布及生產現狀[J].落葉果樹， 1996（3）：29-30.

[4] Li M M，Cai Y L，Qian Z Q， et al. Genetic diversity and differentiation in Chinese sour cherry Prunus pseudocerasus Lindl.， and its implications for conservation[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2009， 56（4）： 455-464.

[5] Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20： 176-183.

[6] Sanchez de la Hoz M P，Davila J A，Loarce Y，et al. Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley [J]. Genome， 1996， 39（1）： 112-117.

[7] Ratnaparkhe M B，Santra D K，Tullu A，et al. Inheritance of inter-simple-sequence-repeat polymorphisms and linkage with a fusarium wilt resistance gene in chickpea [J].Theor. Appl. Genet.， 1998， 96（3/4）： 348-353.

[8] 陳新.榛子花芽轉錄組文庫的Solexa 測序及冷調節基因的表達譜分析[D].北京：中國林業科學研究院，2011.

[9] Nybom H， Bartish I V. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants [J]. Perspectives in Plant Ecology， Evolution and Systematics， 2000， 3（2）：93-114.