L-半胱氨酸與L-胱氨酸間相互轉化的拉曼光譜研究

黃燕飛，廖海星，唐和清

(1.中南民族大學 化學與材料科學學院，湖北 武漢 430074;2.長江大學 化學與環境工程學院，湖北 荊州 434020)

半胱氨酸是含硫氨基酸中的一種，也是生物體必需氨基酸中的一種，是多數蛋白質和酶的空間結構和功能組成部件的重要組成成分。由于半胱氨酸容易形成具有二硫鍵結構的胱氨酸，或者是在含有半胱氨酸殘基的多肽中，容易形成二硫鍵，因此，對于蛋白質的穩定化并保持一定的功能具有重要的作用［1-3］。此外，它對于在細胞中維持氧化還原平衡，影響細胞生長、分化和增值具有重要作用的谷胱甘肽的產生也是必不可少的［4］，且有助于修復由甲基化試劑引起的DNA 損傷［5-6］。在生理條件下，巰基很容易去質子化，其形成的巰基鹽是大多數蛋白質中活性官能團的來源。其中最常見的是巰基和二硫鍵間的相互轉化反應，這一反應涉及了細胞新陳代謝的許多方面，包括蛋白質的折疊、電子的轉移，以及許多的調控機制［7-8］。

在研究多肽中半胱氨酸巰基的離子化以及S─H 與S─S 鍵間相互轉化反應的過程中，Bulaj 等采用反相高效液相色譜分離及UV 吸收檢測的方法，監測了16 種典型多肽中半胱氨酸殘余巰基與4 種不同的二硫化物試劑之間的反應，得到了巰基與二硫鍵間相互轉化的速率常數，并確定了靜電效應是影響巰基與二硫鍵間相互轉化的主導因素。然而，此方法需要進行大量的前處理工作和后續繁瑣的數據擬合處理，才能得到速率常數，進而判斷S─H 與S─S 之間相互轉化的關系。Watanabe 等［9］采用電化學和拉曼結合的方法，研究了胱氨酸(100 mmol/L 溶液)在銀電極上的氧化還原，發現當電極電位到達－0.05 V 時，可觀察到502 cm－1處的S─S 鍵的伸縮振動峰;隨著電極電位的降低，此峰強逐漸減弱，到－0.3 V 時消失;但當電極電位逐漸向+0.3 V 正移時，此拉曼峰恢復可見并逐漸增強。這表明胱氨酸發生了準可逆的二硫化物與硫醇間的電化學相互轉化。但是，在半胱氨酸溶液中并未觀察到上述現象。由于在實驗方法上的困難，有關L-半胱氨酸與L-胱氨酸間相互轉化的直接研究還很少見。

隨著Raman 光譜儀制造技術的發展以及納米化表面拉曼增強(SERS)基底材料的開發，SERS 在監控反應過程中的應用越來越方便。最近我們課題組開發了專門的高性能SERS 基底材料，并以此為基礎，提出了氨基酸檢測的高靈敏SERS 分析方法［10］。在本工作中，我們將采用石墨烯/納米銀(GO/Ag NPs)復合物為基底，利用SERS 技術，以L-半胱氨酸作為巰基試劑，探究了半胱氨酸與胱氨酸之間的巰基與二硫鍵的相互轉化，為探究實際生物體內蛋白質或多肽鏈間二硫鍵與巰基之間的相互轉化，維持生理平衡提供參考依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硝酸銀、石墨、硼氫化鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、濃硫酸、高錳酸鉀、鹽酸羥胺均為分析純;L-半胱氨酸、L-胱氨酸均購于阿拉丁化學試劑有限公司;實驗用水為超純水(＞18.2 MΩ·cm)。

Tecnai G220 S-TWIN 透射電子顯微鏡;Evolution 201 紫外可見分光光度計;DXR Raman Microscope 激光共焦顯微拉曼;Micropure UV 超純水制備儀。

1.2 基底材料的制備

采用改進的Hummers 法制備GO［11］，最終得到4.5 mg/mL 的分散液。在使用之前，先在70%功率的超聲清洗儀下超聲處理30 min。銀納米粒子(Ag NPs)則采用超聲輔助NH2OH·HCl 還原AgNO3的方法制備得到［12］。取適量的Ag NPs 懸濁液，加入一定體積的GO，得到GO 濃度為0. 01 mg/mL 的GO/Ag NPs 懸濁液，攪拌均勻后，靜置過夜。GO/Ag NPs 懸濁液呈堿性。

1.3 實驗方法

取100 μL GO/Ag NPs 復合材料加入到2 mL 不同濃度的半胱氨酸溶液中，攪拌混合均勻，靜置吸附30 min 后，取5 μL 滴在干凈的玻璃片上，環境條件下自然晾干。采用Thermo Fisher 的DXR Raman 對半胱氨酸與胱氨酸之間巰基與二硫鍵間的相互轉化進行監測，激光波長532 nm，激光能量10 mW，曝光時間5 s。文中如無特別說明，拉曼譜圖均是在相同條件下所得。

2 結果與討論

2.1 GO 和Ag NPs 的UV-Visible 分析

GO、Ag NPs 以及GO/Ag NPs 的紫外可見吸收光譜見圖1。

圖1 GO(a)，Ag NPs(b)及GO/Ag NPs(c)分散液的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-visible absorption spectra of (a)GO，(b)Ag NPs and (c)GO/Ag NPs dispersions

由圖1 可知，GO 在226 nm 處有一最大吸收峰，在約300 nm 有一肩峰，與文獻報道相符合［13］。銀納米粒子在425 nm 有最大吸收峰，當GO 和Ag NPs復合之后，在437 nm 處出現了新峰。該峰為Ag 納米粒子的表面共振吸收峰［13］，說明GO 與Ag NPs形成了復合物。GO/Ag NPs 的TEM 見圖2。

圖2 GO/Ag NPs 的TEM 照片Fig.2 TEM image of the GO/Ag NPs composite

由圖2 可知，Ag NPs 較均勻地分布GO 表面，形成了復合物，與紫外可見吸收光譜的結果相吻合。

2.2 L-半胱氨酸(L-Cys)的Raman 研究

采用GO/Ag NPs 作為基底材料，在激光波長532 nm，激光能量10 mW，曝光時間5 s，測得的不同濃度半胱氨酸的拉曼光譜見圖3。

圖3 不同濃度L-半胱氨酸的Raman 譜圖Fig.3 Raman spectra of L-cysteine at different concentrations

由圖3 可知，在較高濃度下，L-半胱氨酸位于2 550 cm－1的特征峰清晰可見，而且強度相當高，屬于S─H 的伸縮振動［14］。當L-半胱氨酸的濃度降低至10－3mol/L 時，2 550 cm－1處的峰幾乎消失，到10－4mol/L 時已完全檢測不到，但500 cm－1處卻出現了新的峰，屬于S─S 的伸縮振動［14］。上述變化表明，隨著L-半胱氨酸濃度的降低，S─H 鍵趨于消失，而S─S 不斷增多。也就是說，該體系中存在S─H 鍵與S─S 鍵之間的相互轉化，半胱氨酸被轉化成了胱氨酸。

由于在本工作中，所用的GO/Ag NPs 懸浮液呈堿性(pH≈8.5)，當L-半胱氨酸的濃度較高時，測試體系呈酸性，而當L-半胱氨酸的濃度降低時，測試體系的pH 值將逐漸升高，接近GO/Ag NPs 懸浮液的初始pH 值(pH≈8.5)。例如，當半胱氨酸的濃度為10－3mol/L 時，體系的pH 值已達到7.2，為弱堿性?？紤]到L-半胱氨酸中的巰基(─SH)容易受到pH 的影響，上述觀察到的S─H 向S─S 轉化的濃度依存性可能實際上是pH 依存性。因此，選擇半胱氨酸濃度為10－2mol/L，采用HNO3將體系的pH值調節至酸性，實驗結果見圖5。

圖4 拉曼譜圖Fig.4 Raman spectra

圖5 不同pH 條件下L-半胱氨酸(10 －2 mol/L)的拉曼譜圖Fig.5 Raman spectra of L-cysteine (10 －2 mol/L)at different pH values

由圖5 可知，當體系的pH 值由7.6 降至3.5時，S─H 的峰強逐漸增強，而S─S 的峰逐漸消失，與之前的假設相符，可以確定體系的pH 變化是致使2 550 cm－1和500 cm－1的峰發生變化的主要原因。并且，變化前2 550 cm－1的峰面積與變化后2 500 cm－1和500 cm－1的兩峰面積的加和具有1 ∶0.9 ～1 ∶1.1 的相關性?？梢?，10－3mol/L 時得到的拉曼譜圖是半胱氨酸和胱氨酸兩混合物的拉曼譜圖。此外，關于激光誘導產生反應的情況也已有報道［15］，因此，除了體系的pH 值能對巰基與二硫鍵間的相互轉化產生影響之外，檢測過程中使用的激光也可能成為誘導半胱氨酸轉化成胱氨酸的原因。為了避免因pH 變化帶來的影響，選擇半胱氨酸的濃度為10－2mol/L 時和半胱氨酸對照品作為在不同曝光時間下探討激光誘導反應的體系來證實激光對半胱氨酸轉化成胱氨酸是否有影響。實驗結果見圖6、圖7。

圖6 不同曝光時間下半胱氨酸(10 －2 mol/L)的拉曼譜圖Fig.6 Raman spectra of L-cysteine (10 －2 mol/L)under different exposure time

圖7 不同曝光時間下半胱氨酸對照品的拉曼譜圖Fig.7 Raman spectra of L-cysteine reference substance in solid state under different exposure time

由圖6、圖7 可知，不管是在GO/Ag NPs 基底上10－2mol/L 時的L-半胱氨酸樣品，還是單純的L-半胱氨酸固體對照品，在激光曝光時間大大增加時，仍然沒有觀察到S─H 與S─S 之間的相互轉化，即沒有半胱氨酸與胱氨酸之間的相互轉化。由此，可以肯定，僅在激光輻照的條件下是不能夠對半胱氨酸轉化成胱氨酸產生誘導作用的，體系pH 變化是導致半胱氨酸轉化成胱氨酸的主要因素(圖8)。

圖8 半胱氨酸與胱氨酸分子在銀納米粒子表面的吸附及相互轉化Fig.8 The adsorption and transformation of L-cysteine and L-cystine molecules on surface Ag nanoparticles

3 結論

采用GO/Ag NPs 復合材料作為拉曼光譜基底，監測到了半胱氨酸與胱氨酸之間相互轉化的過程，并探究了產生這一相互轉化的主要原因，確定了在堿性條件下，有利于半胱氨酸與胱氨酸的相互轉化，并給出了可能的機理，為探究實際生物體系內涉及巰基與二硫鍵間相互轉化的重要反應提供了一定的參考依據。

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