用HPLC 分析對胍基苯甲酸鹽酸鹽含量的研究

曲秦，李宗霖，麻紀斌，陳雁，翟帆

(1.陜西新藥技術開發中心，陜西 西安 710075;2.西安市第五醫院，陜西 西安 710082)

對胍基苯甲酸鹽酸鹽是一種常用的醫藥工業中間體，為頂體蛋白酶的抑制劑［1］，用于合成抗胰腺炎藥物甲磺酸卡莫司他和萘莫司他，以及合成許多其他蛋白酶抑制劑。它們所含的胍基具有很強的生理活性，可在配基與受體及酶與底物間通過氫鍵作用形成特殊的相互作用，因此近些年對胍基化合物的研究日益深入。對胍基苯甲酸鹽酸鹽在抗生育領域有廣泛的應用前景，有望發展成為避孕藥系列產品［2］。

對胍基苯甲酸化學性質穩定，可溶性差，常以鹽酸鹽的形式用于藥物合成［3］。在對胍基苯甲酸鹽酸鹽合成中可能引入副產物及未反應完全的反應物，作為中間產品的控制需要提供準確的檢測方法。

本文采用HPLC［4］法測定對胍基苯甲酸鹽酸鹽含量，具有操作方便、測定結果準確可靠、檢出限好等優點。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品和樣品均為自制;純凈水;乙腈，色譜純;醋酸，分析純。

Ag135 電子天平;Waters 高效液相色譜儀;PHS-3C 型精密pH 計;KQ-300VDE 型雙頻數控超聲波清洗器。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照品溶液制備精密稱取對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品20.0 mg，置25 mL 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1 mL 至新的10 mL 容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2 供試品溶液制備精密稱取對胍基苯甲酸鹽酸鹽供試品10.0 mg，置50 mL 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1 mL 至新的10 mL 容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱為反相C18柱(250 mm ×4.6 mm);流動相為醋酸鹽緩沖液(pH =3.0)∶乙腈=70 ∶30(V/V);檢測波長251 nm;流速0.5 mL/min;進樣量20 μL，柱溫為30 ℃。理論板數按對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰計算不低于2 000。主峰與雜質峰的分離度＞1.5。

1.4 標準曲線的制備

精密稱取干燥至恒重的對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品100 mg，置50 mL 量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取0. 5，1. 0，2. 0，3. 0，4.0，5.0，6.0 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別取供試品溶液各20 μL 進樣，以峰面積對濃度作標準曲線，見圖1。

圖1 對胍基苯甲酸鹽酸鹽標準曲線Fig.1 Standard curve of 4-guanidinobenzoic acid hydrochloride

以峰面積對濃度作線性回歸，得回歸方程y =7.346x + 2. 502 9，R2= 0. 999 3。可見在2 ～30 μg/mL 范圍內，峰面積與濃度線性關系良好。

2 結果與討論

2.1 精密度實驗

精密量取對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品溶液，按上述色譜條件，分別重復測定5 次，結果見表1。

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision experiment

由表1 可知，對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰面積的RSD 值為1.35%，表明儀器精密度良好。

2.2 重現性實驗

精密稱取同一批樣品5 份，按供試品溶液制備方法平行處理并測定，結果見表2。

表2 重現性實驗結果Table 2 Results of reproducibility experiment

由表2 可知，對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰面積的RSD 值為1.52 %，表明本方法重復性良好。

2.3 穩定性實驗

精密稱取同一批樣品制成供試液，分別于0，2，4，8，12 h 測定峰面積，結果見表3。

表3 穩定性實驗結果Table 3 Results of stability experiment

由表3 可知，對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰面積的RSD 值為2.44%，說明供試液在12 h 內穩定性良好。

2.4 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量(96.97%)的同一批對胍基苯甲酸鹽酸鹽樣品9 份，每份約20 mg，分別精密加入一定量的對照品制備供試品溶液，按色譜條件測定，計算回收率，結果見表4。由表4 可知，回收率為99.45%，RSD=1.32%，表明加樣回收結果良好。

表4 回收率實驗結果(n=9)Table 4 Results of recovery experiment (n=9)

2.5 樣品測定

取對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品及3 批次樣品進行測定，按外標法以峰面積計算含量，見圖2、圖3。

圖2 對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograph of reference of 4-guanidinobenzoic acid hydrochloride

圖3 對胍基苯甲酸鹽酸鹽樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatograph of sample of 4-guanidinobenzoic acid hydrochloride

由圖3 可知，3 批樣品的含量分別為95.1%，96.5%，95.7%。

3 結論

采用HPLC 方法檢測對胍基苯甲酸鹽酸鹽的含量，保留時間為4.688 min，與雜質峰的分離度大于1.5，分離度良好，雜質對對胍基苯甲酸鹽酸鹽的質量檢測無干擾。在含量2 ～30 μg/mL 內，線性關系很好，精密度、重現性和穩定性良好，具有良好的準確度和重現性。適用于對胍基苯甲酸鹽酸鹽工業生產的質量控制。

［1］ 趙亞南，紀亞忠，呂加國，等. 頂體蛋白酶抑制劑4-胍基苯甲酸鹽對人精子功能的影響［J］. 第二軍醫大學學報，2000，21(12):1149-1151.

［2］ 袁德祥，刁筱輝.4-羰基乙氧苯基-4-胍基苯甲酸酯鹽酸鹽對人精子頂體蛋白酶活性的影響［J］. 生殖醫學雜志，1992，1(1):38-42.

［3］ 趙煜松，曾海霞. 對胍基苯甲酸鹽酸鹽質量標準研究［J］.河北化工，2012，35(1):26-28.

［4］ 國家藥典委員會.中國藥典:二部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010.