低溫脅迫對淡竹2個抗寒性生理指標的影響

李麗+王開芳+李自成+孫超+劉翠蘭+夏陽+燕麗萍

摘 要：選擇13個區域的淡竹葉片為試材，分別在0、-5、-10、-15、-20、-25℃下進行低溫脅迫處理，測定其電導率和脯氨酸含量的變化，電導率結合Logistic方程計算出淡竹的半致死溫度。通過脯氨酸含量分析和半致死溫度的計算，綜合分析不同區域淡竹抗寒性的生理生化指標，推測其抗寒性強弱：來源于煙臺林科院、煙臺昆崳山、濰坊的淡竹抗寒性較強，來源于日照、沂源、東營、濟南、臨沂、膠南、泰安的淡竹抗寒性中等，來自浙江、江西、江蘇的淡竹抗寒性最弱。

關鍵詞：淡竹；抗寒性；相對電導率；Logistic 方程；半致死溫度；脯氨酸

中圖分類號：S795.701 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0039-04

淡竹（Phyllostachys glauca McCl.） 又名烏竹、粉綠竹、花皮淡竹，屬禾本科剛竹屬植物，生長快，豐產性好，適應性強，是我國南方主要的優良綠化樹種。淡竹集材用、食用、觀賞、藥用等眾多用途于一體，是一種非常優良的中型筍材兩用竹種。淡竹四季常綠，也是美化環境、調節氣候、保持水土、改良生態環境的優良樹種。由于淡竹良好的經濟價值和生態環境效益，近年來山東省多次引種栽培。目前，山東省淡竹主要分布在沿海溫暖濕潤地區，現有淡竹林面積約1 300 hm2，約占全省竹林總面積80%以上，但由于缺乏系統研究和推廣，淡竹在山東省還沒有形成像浙江、江西等地一樣的規模性效益、創造出應有的經濟生態價值。影響淡竹生長的主要因素是溫度和濕度，其中低溫是影響我國北方地區竹類植物在園林綠化中得不到廣泛推廣的最重要的因子。為擴大淡竹的適宜種植范圍，在人工調控溫度條件下，研究了低溫脅迫對其生理指標的影響。

植物抗寒性評價大多數集中在細胞膜和生理活性物質的研究。膜系統是植物受低溫傷害和抵抗低溫傷害的關鍵結構，抗寒性弱的植物，細胞膜透性增大程度較快。這種變化大多出現在形態變化之前，因而質膜的透性變化可顯示細胞膜結構和功能的受損程度。用電導儀測定細胞外滲液電導率即相對電導率變化，是用來反映細胞膜傷害程度和大小的一個重要指標。目前，采用電導法結合Logistic 方程在植物抗寒性研究中的報道較多[1]。徐傳保等[2]采用電導法測定了竹子的抗寒性，與實際觀測基本一致。脯氨酸的含量也是用來反映抗寒性的主要指標，Delauney等[3]認為，脯氨酸在植物抗寒中作為滲透調節物質起作用；Rajendrakumar等[4]研究發現，脯氨酸在植物的抗寒作用中主要保護蛋白質，維持其最基本的生理功能；Anjum等[5]認為，脯氨酸在低溫條件下主要作為活性氧清除劑，保護細胞膜不受破壞；還有研究認為，脯氨酸作為能源物質在抵御寒冷脅迫中發揮作用[6]。本試驗研究了低溫脅迫對淡竹葉片電解質外滲率和脯氨酸含量的影響，探討淡竹耐寒性的生理機制，提出其忍受的臨界低溫，旨在為淡竹的抗寒性篩選、育種、栽培和引種推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試淡竹來源于日照、沂源、東營、濟南、濰坊、臨沂、膠南、泰安、煙臺昆崳山、江西、浙江、江蘇及煙臺林業科學研究院，栽植在山東省林業科學研究院濟南試驗苗圃竹子引種基地。該地位于北緯36°02′～37°31′，東經116°11′～117°44′，四季分明，氣候溫和，年平均氣溫為14.9℃，極端最低氣溫-22.5℃，年降水量665.7 mm。試驗地土壤為褐土，pH 7.1，中等偏下肥力水平。

1.2 試驗方法

1.2.1 低溫處理 參照徐傳保等[2] 的方法。于2013年12月3日上午8∶ 00～9∶ 00 分別在健壯植株中部枝條取葉，葉片采后用濕紗布包裹，帶回實驗室。用自來水沖洗后，再用蒸餾水沖洗4～5次然后用吸水紙吸干水分。將每個材料的葉片分成6份，其中一份為對照，其余每份置于超低溫調控冰箱進行低溫處理，處理溫度梯度為 0、-5、-10、-15、-20、-25℃， 降溫速度為5℃/h，到達設定的目的溫度時維持12 h。處理后的樣品置于4℃冰箱解凍12 h 后測定各項指標。

1.2.2 相對電導率的測定 將待測葉片除去中脈，剪成3 mm×3 mm 的小片，將不同的葉片充分混合后，稱取0.2 g，倒入試管中，再加20 mL雙蒸餾水，用蓋子蓋緊，在20～30℃ 條件下振蕩1 h，用電導儀測定初電導值（S1 ）。再將各樣品置沸水中煮沸10 min， 取出冷卻，在室溫下平衡10 min，搖勻， 測其終電導值（S2 ）， 以不加葉片的雙蒸餾水作空白測定（S0）。每個處理重復3 次，取平均值。 根據L（%）= （S1-S0）/（S2-S0 ） ×100 ， 計算相對電導率。

1.2.3 游離脯氨酸（Pro）含量測定 采用酸性茚三酮方法測定[7]。稱取不同處理混勻的葉片0.5 g，分別置于帶塞的試管中，每個處理重復3 次，取平均值。從標準方程中求出提取液中脯氨酸含量，按照公式計算出葉片脯氨酸含量。

脯氨酸含量（mg/g）=[提取液中脯氨酸質量（mg）×提取液總體積（mL）×1000]/[測定時所吸取提取液的總體積（mL）×樣品質量（g）]。

1.3 數據處理

采用DPS 軟件將溫度（t） 和相對電導率（y） 用Logistic方程y=k/（1+ae-bt）進行擬合，求出相對電導率的拐點溫度，即為低溫半致死溫度（LT50）[8]。用單因素方差分析處理組間的差異。

2 結果與分析

2.1 不同低溫脅迫對相對電導率的影響

由表1可見，隨著溫度降低，不同來源淡竹的相對電導率均出現不同程度的增加。來源于江西、浙江和江蘇的淡竹在溫度達-15℃ 時相對電導率急劇上升， 分別比-10℃ 時增加98%、130%和98%，而來自山東日照、沂源、東營、濟南、濰坊、臨沂、膠南和泰安的淡竹則在溫度到達-20℃時相對電導率才出現急劇上升，增幅達60%以上，當溫度下降到-25℃時， 煙臺昆崳山淡竹相對電導率達到61.96%，而煙臺林科院新種質淡竹依然保持平穩的相對電導率， 只有47.87%。可見，煙臺林科院淡竹耐寒性最強，其次是煙臺昆崳山淡竹，來自江西 、浙江和江蘇的淡竹耐寒性最差。測定結果作方差分析，不同區域間淡竹和溫度處理間相對電導率差異達5%顯著水平，可見不同區域之間隨著溫度的降低耐寒性表現出很大的差別。區域間多重比較結果顯示，耐寒性之間的差異主要表現在煙臺林科院淡竹和江西淡竹、浙江淡竹、江蘇淡竹及其它區域之間（表略）。endprint

Logistic方程是一個典型的“S”曲線方程，淡竹葉片相對電導率隨溫度的變化呈“S”型曲線，利用相對電導率擬合Logistic方程求出植物組織的低溫半致死溫度（LT50），見表1。結果表明，不同來源的淡竹抗寒性有一定的差異，LT50越高，抗寒性越弱，LT50越低，抗寒性越強。從半致死溫度所反映的淡竹耐寒性強弱來看，煙臺林科院淡竹半致死臨界溫度為-26.78℃，耐寒性最強，煙臺昆崳山淡竹半致死臨界溫度為-23.86℃，耐寒性較強，浙江淡竹半致死臨界溫度為-15.76℃，耐寒性最弱，其次江西淡竹半致死臨界溫度為-16.18℃，耐寒性較弱。

2.2 低溫脅迫對淡竹葉片游離脯氨酸含量的影響

由圖1可見，0℃時供試的13個區域淡竹葉片的游離脯氨酸含量無明顯差異，隨著溫度的降低，游離脯氨酸的含量開始升高，當溫度降至-10℃時，除煙臺林科院淡竹外，其它淡竹葉片游離脯氨酸含量均上升到最大值，濟南淡竹葉片游離脯氨酸含量最高為1.24 mg/g，其次是濰坊和煙臺昆崳山淡竹，分別為1.13 mg/g 和1.12 mg/g。當溫度降至-15℃時，煙臺林科院淡竹葉片游離脯氨酸含量達到最大值1.52 mg/g，其余淡竹葉片游離脯氨酸含量下降為最小值。隨著溫度繼續降低，游離脯氨酸含量均繼續回升，當溫度達到-25℃時，所有淡竹的游離脯氨酸含量較0℃時均有所增加，增幅較大的是來自煙臺林科院、濰坊、日照、東營、膠南、沂源和煙臺昆崳山的淡竹；增幅較小的是來自江西、浙江和江蘇的淡竹。對不同處理溫度下的淡竹葉片游離脯氨酸含量進行方差分析，結果表明， Sig.=0.018<0.05，且FA=6.727>F0.05=1.195，不同溫度處理間淡竹葉片游離脯氨酸含量差異顯著； Sig.=0.000<0.01，且FB=18.991>F0.01=4.219，不同區域間淡竹葉片游離脯氨酸含量差異極顯著。煙臺林科院淡竹葉片游離脯氨酸含量平均值最大，其次是濰坊和煙臺昆崳山淡竹；江西淡竹和浙江淡竹最小，來自日照、沂源、濟南、東營、濰坊、膠南、泰安、煙臺昆崳山、臨沂的淡竹葉片游離脯氨酸含量平均值間差異不顯著，但顯著低于煙臺林科院淡竹 （表略）。

3 結論與討論

目前，竹類植物抗寒性的調查局限于外觀形態的研究，要想真正了解不同區域淡竹的生長極限溫度，確定其適宜生長范圍，還必須從抗寒生理機理內部因素進行研究。低溫引起細胞膜透性發生變化，是植物低溫傷害的一個重要原因[5]。生物膜結構的變化是研究抗寒機理的重要問題，膜的性質、結構和相變是寒害原初反應的重要指標，而在遺傳基因控制范圍內，膜脂成分的不飽和度以及細胞質黏度和流動性可作為抗寒性強弱的重要生理指標[9]。一般膜透性與抗寒性的關系可通過植物低溫處理后的電解質滲出率來反映，也是目前研究測定植物抗寒性的最常用的試驗方法。進行細胞膜透性和抗寒性的關系研究以及其動態變化，可以從細胞膜方面揭示竹類植物抗寒性的機理[10，11]。徐傳保等[12]采用電解質外滲率評價4種淡竹的抗寒性，結果表明，4種竹子抗寒性的強弱順序與形態觀察結果完全一致，采用電解質外滲率評價竹子抗寒性結果較穩定。本試驗中，在0℃至-15℃溫度脅迫下淡竹葉片的相對電導率變化比較平緩，在-25℃低溫脅迫下急劇上升，表明脅迫溫度越低，細胞受傷害越重。這與黃程前等[13]報道的低溫脅迫20種觀賞叢生竹的抗寒性測定結果一致，張志[14]在溫度脅迫早熟禾的研究中也得到相同的結果。王永紅等[15]研究結果表明電解質外滲率與低溫脅迫山茶葉片褐變所表現的規律較吻合，證明電解質外滲率反映山茶物種耐寒性強弱較為客觀真實。上述諸多研究結果說明，電解質外滲率可以作為判斷植物抗寒力強弱的重要指標。在低溫脅迫下，相對電導率與溫度之間的關系曲線，能較好地用Logistic曲線方程y=k/（1+ae-bt）進行擬合，計算出不同區域淡竹的半致死溫度。從半致死溫度來看，本試驗13個區域淡竹的抗寒性強弱順序為：煙臺林科院>煙臺昆崳山>濰坊>臨沂>日照>膠南>東營>濟南>泰安>沂源>江蘇>江西>浙江。

游離脯氨酸作為滲透調節物質，大多數研究證明其含量和植物抗寒性有很大的相關性，其含量在植物可忍受的低溫脅迫下，呈現出上升的趨勢[16]。李建設等[17]發現茄子幼苗脯氨酸含量的增加幅度與品種的抗寒性強弱存在密切相關性。楊靜等[18]在研究低溫脅迫對 1年生紅葉石楠品種魯賓斯（Photinia glabra var. Rubens）盆栽扦插苗葉片組織生理生化特性的影響時發現，隨著脅迫溫度降低和脅迫時間的延長，脯氨酸含量增加。從本試驗結果來看，通過不同低溫脅迫處理后，不同區域淡竹葉片中的游離脯氨酸含量差異較大，游離脯氨酸含量達到最大值的時間也不同。除煙臺林科院淡竹葉片中游離脯氨酸含量最大值1.52 mg/g出現在-15℃外，其余所有淡竹葉片中游離脯氨酸含量最大值出現在-10℃。當溫度達到-25℃時，所有竹子的游離脯氨酸含量較0℃時均有所增加，增幅較大的為煙臺林科院淡竹、濰坊淡竹；增幅較小的為江西淡竹、浙江淡竹和江蘇淡竹。同時研究結果表明，抗寒性強的煙臺林科院淡竹葉片中游離脯氨酸含量高于抗寒性弱的江西淡竹，該研究結果與自然界分布的各物種所表現的抗寒性強弱基本相一致，在實踐中對引種與生產有一定的指導意義。

參 考 文 獻：

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