花生濃縮蛋白超聲改性的工藝條件*

趙雪淞，藺雅菲，劉民

1(遼寧工程技術(shù)大學(xué) 礦業(yè)學(xué)院，遼寧 阜新，123000)2(遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧阜新，123000)

花生濃縮蛋白是從脫脂花生粕中除去可溶性糖、灰分等，制得蛋白含量65%(N×6.25，干基)以上的花生蛋白產(chǎn)品，可作為食品添加劑及糧食強(qiáng)化劑廣泛應(yīng)用于食品及飼料工業(yè)［1］。制取花生濃縮蛋白的方法主要有乙醇浸提法和堿溶酸沉法［2，3］。堿溶酸沉法能制得氮溶解指數(shù)(NSI)較高的產(chǎn)品，但其風(fēng)味和色澤不如醇洗法制備的產(chǎn)品好，且有大量廢水排放。乙醇浸提法是較好的濃縮蛋白制備方法，但該方法的缺點(diǎn)是溶解性偏低，持水性、乳化穩(wěn)定性及凝膠性較差，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［2－4］。為了充分利用花生濃縮蛋白，提高其附加值，必須改善其功能性質(zhì)。花生蛋白改性方法主要有物理改性、化學(xué)改性和酶法改性［5］。其中物理改性方法由于具有無毒、可接受性高的特點(diǎn)，更利于在食品工業(yè)中應(yīng)用。本文以自制的醇洗花生濃縮蛋白為原料，考察了超聲波處理功率和處理時(shí)間對(duì)花生濃縮蛋白各項(xiàng)功能性質(zhì)(溶解性、乳化活性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性、吸水性、持油性和凝膠性質(zhì))的影響，并優(yōu)化了改性條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂花生蛋白粉，阜新黑土地油脂有限公司提供。

Scientz－12型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;BM251C型粉碎機(jī)，廣東美的精品電器制造有限公司;HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;KDC-160HR型高速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;2DP-150型震蕩培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;S10型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司;752型分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司;78－1型磁力攪拌器，寧波新芝生物科技股份有限公司;SCIENTZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司;2300型自動(dòng)定氮儀、Soxtec Avanti 2050型自動(dòng)索氏總脂肪分析系統(tǒng)，瑞典Foss公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料和產(chǎn)品主要成分的測定

蛋白質(zhì)含量測定:凱氏定氮法，參照 GB/T 5009.5－2010;脂肪含量的測定:索氏提取法，參照GB/T 5009.6－2003;水分含量的測定:直接干燥法，參照GB/T 5009.3－2010;灰分含量的測定，參照GB 5009.4－2010;總糖含量的測定:苯酚硫酸法。

1.2.2 花生濃縮蛋白的制備方法

將脫脂花生蛋白粉過20目標(biāo)準(zhǔn)篩，然后準(zhǔn)確稱取2 g裝入三頸瓶中。將配置成體積分?jǐn)?shù)75%濃度的乙醇溶液置于水浴鍋中加熱，當(dāng)達(dá)到50℃時(shí)按料液比(g∶mL)1∶6加入三頸瓶中，保持溫度 30 min，然后離心分離，所得沉淀再次浸洗，浸洗物離心分離(3 000 r/min，20 min)，浸洗3次，最后將蛋白沉淀冷凍干燥，即得到濃縮蛋白產(chǎn)品［6］。

1.2.3 超聲波處理方法

按1.2.2比例放大制備花生濃縮蛋白。稱取花生濃縮蛋白50 g，加入45℃的熱水溶解于燒杯中，配置成8%的蛋白溶液，旋渦振蕩均勻后，調(diào)節(jié)該蛋白溶液的pH值為7.2，再放置于超聲波發(fā)生器內(nèi)，將超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)的探頭深入液面下2 cm，在一定功率下超聲振蕩一定時(shí)間，最后冷凍干燥得改性產(chǎn)品，測定功能特性。

1.2.4 蛋白溶解性測定

半微量凱氏定氮法，參照GB5511－1985。

1.2.5 蛋白吸水性測定

10%的蛋白液10 mL移入15 mL離心管中，旋渦震蕩2 min確保蛋白全部均勻分散，室溫下靜置30 min，離心3 000 r/min，20 min。棄上清液，稱重。試驗(yàn)做3次重復(fù)。吸水性為每克蛋白結(jié)合水的克數(shù)。

1.2.6 蛋白持油性測定

稱取1g蛋白(m0)，加入10mL(V1)大豆油，并用旋渦震蕩儀使溶液混合均勻，室溫下靜置30 min，離心3 000 r/min，20 min，迅速將上層物小心移入干燥的10 mL量筒中，記錄體積(V2)。試驗(yàn)做3次重復(fù)。持油性/

1.2.7 蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

采用濁度法測定，具體操作如下:取0.5 g/L濃度的蛋白溶液40mL，加入40 mL大豆油;用高速分散器(12 000 r/min)攪拌2 min;用注射器從底部取50 μL乳狀液，與10 mL 0.1%的SDS緩沖溶液混合均勻，在500 nm波長下比色，記錄吸光度(E0);10 min后再從底部取50 μL乳狀液，同樣稀釋比色，記錄吸光度(Et)。蛋白質(zhì)的乳化性以E0表示，乳化穩(wěn)定性=Et/E0，試驗(yàn)做3 次重復(fù)［7］。

1.2.8 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定

1%的蛋白質(zhì)溶液(pH 7.4)取100 mL，用高速分散器(12 000 r/min)攪拌3 min;轉(zhuǎn)入量筒，盡快記錄泡沫體積(V0)，靜置15 min、30 min后各再次記錄泡沫體積(Vt)。

1.2.9 蛋白最低凝膠點(diǎn)的測定

取蛋白樣品溶于10 mL 0.1 mol/L的NaCI溶液中，制成 20、60、100、140、180 g/L 的溶液，調(diào) pH 值到7.0，在90℃水浴中加熱60 min，冷至室溫，置于4℃條件下12 h以上，觀察凝膠情況:凝膠不流動(dòng)的樣品為“+”，可形成凝膠;反之為“－’，不能形成［7］。

1.2.10 游離及總巰基含量測定

樣品60 mg于10 mL含有8 mol/L尿素的的緩沖液(Tris-Gly，pH 8.0)中攪拌溶解1 h，離心(12 000 r/min)10 min。游離巰基(SHF)測定:2 mL上清液，加入 80 μL Ellman’s試劑，4 mg/mL DTNB(5，5’-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)，立刻混勻，5 min后測412 nm吸光度。總巰基(SHT)測定:取2 mL上清液，加入0.2%巰基乙醇處理樣品2 h后，加入12%三氯乙酸(TCA)4 mL，靜置1 h，離心(12 000 r/min)10 min，12%TCA洗滌沉淀4次，沉淀溶于3 mL Tris-Gly緩沖液中，取2mL液體測巰基含量。以Ellman’s試劑-SH的摩爾吸光系數(shù)1.36×104計(jì)算蛋白質(zhì)的—SH含量。

式中:A412:412 nm吸光度，c:樣品濃度(mg/mL)，73.53:106/(1.36 ×104)。二硫鍵(—S—S—)=(SHT－ SHF)/2［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生粕和花生濃縮蛋白的組分含量

本研究以冷榨花生粕為原料，采用乙醇浸提法自制花生濃縮蛋白。由表1可知，花生粕中蛋白質(zhì)含量為37.23%，而制備成濃縮蛋白之后蛋白質(zhì)含量有明顯的增加，達(dá)到71.05%，同時(shí)水分、灰分、脂肪等含量明顯下降，各項(xiàng)組分指標(biāo)符合花生濃縮蛋白的質(zhì)量要求。

表1 花生粕和花生濃縮蛋白各組分的含量%Table 1 The content of various components of the peanut meal and peanut protein concentrate%

2.2 超聲處理強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響

2.2.1 吸水性

蛋白質(zhì)組分吸附和持留水分的能力對(duì)食品組成結(jié)構(gòu)和品質(zhì)有重要作用。由圖1可知，不同超聲強(qiáng)度處理后的花生濃縮蛋白吸水性呈先上升后下降的趨勢，超聲功率為700 W時(shí)吸水性達(dá)到最大值2.550 g/g，繼續(xù)加大超聲功率吸水性開始下降。因此，700 W確定為吸水性的最優(yōu)超聲功率。

圖1 超聲處理強(qiáng)度對(duì)蛋白吸水性的影響Fig.1 Effect of ultrasonic irradiation power on water holding capacities of protein

2.2.2 持油性

蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的相互作用受諸多因素的影響。非共價(jià)鍵是蛋白與油脂間的主要作用力，其次是氫鍵和疏水相互作用力。蛋白質(zhì)的持油性在肉制品、焙烤食品、油炸食品等加工中起著非常重要的作用。由圖2可知，超聲功率在100～500 W時(shí)，持油性變化不明顯，500 W后，持油性升高，700 W時(shí)持油性達(dá)到最大值，繼續(xù)加大功率，持油性快速下降。因此，700 W為持油性的最優(yōu)超聲功率。

圖2 超聲處理強(qiáng)度對(duì)蛋白持油性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic irradiation power on oil binding capacities of protein

2.2.3 溶解性

蛋白產(chǎn)品的溶解性好是其作為食品蛋白質(zhì)原料的首要條件，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶解性影響著許多其他功能特性，尤其是增稠、乳化、起泡和凝膠性質(zhì)，也會(huì)對(duì)其在食品中的穩(wěn)定性和風(fēng)味等有直接影響［8］。其溶解性衡量指標(biāo)是氮的可溶性指數(shù)(NSI)。由圖3可知，隨著超聲強(qiáng)度的升高，花生濃縮蛋白的溶解性呈一直上升的趨勢。而本實(shí)驗(yàn)中所用的最大功率即900 W已達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的最大功率值。因此，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)實(shí)條件為準(zhǔn)，900 W為溶解性的最優(yōu)超聲功率。

2.2.4 乳化性及其乳化穩(wěn)定性

乳化能力是衡量蛋白質(zhì)促進(jìn)油-水型乳狀液形成能力的指標(biāo)。乳化穩(wěn)定性是指維持乳狀液穩(wěn)定存在的能力。蛋白質(zhì)是一種表面活性劑，它能降低水和油的表面張力，使之易于乳化。另一方面，蛋白質(zhì)分散在非連續(xù)相和連續(xù)相之間的界面上，能夠阻止非連續(xù)相的聚集，起到穩(wěn)定乳狀液的作用。由圖4可知，不同超聲強(qiáng)度處理后的花生濃縮蛋白乳化性呈先上升后下降再趨于平緩的趨勢，功率從100 W上升到300 W時(shí)，乳化性迅速上升，功率為500 W時(shí)乳化性下降，繼續(xù)加大功率到700 W以上時(shí)，乳化性上升并逐漸趨于平穩(wěn)。不同超聲強(qiáng)度處理后，花生濃縮蛋白的乳化穩(wěn)定性同樣在700 W后呈現(xiàn)趨于平緩的趨勢。因此，700 W確定為乳化性及乳化穩(wěn)定性的最優(yōu)超聲功率。

圖3 超聲處理強(qiáng)度對(duì)蛋白溶解性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic irradiation power on protein solubility

圖4 超聲處理強(qiáng)度對(duì)蛋白乳化性及其乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of ultrasonic irradiation power on emulsifying capacity and emulsifying stability of protein

2.2.5 起泡性及其泡沫穩(wěn)定性

泡沫的形成類似于乳化液的形成。泡沫形成于水分子對(duì)空氣的包裹，空氣是非極性介質(zhì)，而蛋白是兩性分子，因此它可以作為空氣-水表面的介質(zhì)促成泡沫形成［9］。由圖5可知，在功率達(dá)到700 W以后，起泡性及其泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最大，繼續(xù)加大功率，變化不大。因此，700 W為起泡性及其泡沫穩(wěn)定性的最優(yōu)超聲功率。

圖5 超聲處理強(qiáng)度對(duì)蛋白起泡性及其泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of ultrasonic irradiation power on foaming capacity and foaming stability of protein

2.2.6 蛋白最低凝膠點(diǎn)

凝膠性是蛋白的重要功能性質(zhì)之一，它賦予食品良好的凝膠組織結(jié)構(gòu)，使食品對(duì)水分、脂質(zhì)、糖類和其他成分具有良好的束縛作用，同時(shí)增加食品咀嚼感，為肉制品保持水分、脂肪提供基礎(chǔ)［10］。蛋白凝膠特性表現(xiàn)在擁有高的黏附力，塑性和彈性。這一性質(zhì)在香腸制品中非常重要，同時(shí)也是豆腐形成的基礎(chǔ)。由表2可以看出，超聲功率為100 W時(shí)，蛋白濃度為18%時(shí)才能形成凝膠，而超升功率為700 W時(shí)，在蛋白濃度為10%時(shí)形成了良好的自持凝膠，因此，700 W為蛋白形成凝膠的最優(yōu)功率，10%濃度為蛋白最低凝膠點(diǎn)。

表2 超聲處理強(qiáng)度對(duì)蛋白凝膠性的影響Table 2 Effect of ultrasonic irradiation power on gelatin of protein

2.2.7 游離巰基及二硫鍵含量的測定

超聲波可促使蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)部的非共價(jià)鍵、—S—S—等斷裂，增加蛋白中的—SH含量，提高蛋白的表面親水性，以此增加蛋白的溶解性，同時(shí)保存蛋白中的—SH含量并使其在速凝階段發(fā)揮作用［7］。由圖6可知，超聲處理對(duì)蛋白質(zhì)的速凝性質(zhì)影響明顯。隨超聲功率的增加，蛋白的游離巰基含量緩慢增加，900 W時(shí)上升到10.91 μmol/g。雖然游離巰基含量在一直上升，但二硫鍵含量在700 W后已經(jīng)不再下降。因此，700 W為提高蛋白凝膠性的最優(yōu)功率。

綜上所述，超聲功率對(duì)花生濃縮蛋白各項(xiàng)功能性質(zhì)有顯著影響。綜合分析上述結(jié)果，確定700 W為最佳超聲改性功率。為了進(jìn)一步優(yōu)化超聲改性條件，在固定功率70 0W條件下，繼續(xù)研究超聲時(shí)間對(duì)花生濃縮蛋白功能性質(zhì)的影響。

2.3 超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響

2.3.1 吸水性

由圖7可知，隨著超聲時(shí)間延長，花生濃縮蛋白的吸水性呈上升的趨勢，6 min后變化趨于平緩，6 min確定為蛋白吸水性的最優(yōu)超聲時(shí)間。

圖6 超聲處理強(qiáng)度對(duì)蛋白—SH/—S—S—含量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic irradiation power on protein —SH/—S—S—

圖7 超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白吸水性的影響Fig.7 Effect of ultrasonic irradiation time on water holding capacities of protein

2.3.2 持油性

由圖8可知，不同超聲時(shí)間處理后，花生濃縮蛋白的持油性呈先上升后緩慢下降的趨勢，6min時(shí)達(dá)到最大值。因此，6min為蛋白持油性的最優(yōu)超聲處理時(shí)間。

圖8 超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白持油性的影響Fig.8 Effect of ultrasonic irradiation time on oil binding capacities of protein

2.3.3 溶解性

由圖9可知，不同超聲時(shí)間處理后，花生濃縮蛋白的溶解性呈持續(xù)上升的趨勢。原因可能是超聲時(shí)間越長，蛋白分解越多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性上升。

圖9 超聲處時(shí)間度對(duì)蛋白溶解性的影響Fig.9 Effect of ultrasonic irradiation time on protein solubility

2.3.4 乳化性及其乳化穩(wěn)定性

由圖10可知，隨著超聲時(shí)間延長，花生濃縮蛋白的乳化性呈逐漸上升的趨勢，而乳化穩(wěn)定性呈先上升后下降的趨勢，6 min時(shí)乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值。雖然乳化性呈一直上升的趨勢，但乳化穩(wěn)定性超過6 min則呈現(xiàn)下降的趨勢。因此，6 min確定為蛋白乳化及乳化穩(wěn)定性的最優(yōu)超聲處理時(shí)間。

圖10 超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白乳化性及其乳化穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of ultrasonic irradiation time on emulsifying capacity and emulsifying stability of protein

2.3.5 起泡性及其泡沫穩(wěn)定性

圖11 超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白起泡性及其泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of ultrasonic irradiation time on foaming capacity and foaming stability of protein

由圖11可知，不同超聲時(shí)間處理后的花生濃縮蛋白起泡性及其泡沫穩(wěn)定性均在6 min時(shí)達(dá)到最高，之后趨于平穩(wěn)。因此，6 min為起泡性及其泡沫穩(wěn)定性的最優(yōu)超聲時(shí)間。

2.3.6 蛋白最低凝膠點(diǎn)

表3 超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白凝膠性的影響Table 3 Effect of ultrasonic irradiation time on gelation of protein

由表3可知，超聲處理1～2 min時(shí)，花生濃縮蛋白的最低凝膠點(diǎn)是14%蛋白濃度，超聲處理4 min時(shí)，花生濃縮蛋白的最低凝膠點(diǎn)為10%蛋白濃度，繼續(xù)增加處理時(shí)間，最低凝膠點(diǎn)一直處于10%蛋白濃度。因此，4 min為最優(yōu)超聲時(shí)間。

2.3.7 游離巰基及二硫鍵含量

花生濃縮蛋白的速凝特性主要是表現(xiàn)為蛋白質(zhì)分子鏈的展開、斷裂過程，即蛋白經(jīng)改性后，球狀的蛋白質(zhì)分子開始伸展開來，原來包埋在卷曲的分子鏈內(nèi)部的功能基團(tuán)如二硫基，疏水基團(tuán)暴露出來，使得蛋白分子間和分子內(nèi)部的二硫鍵、氫鍵、疏水作用、靜電引力以及范德華力有不同程度的改變，從而使蛋白具有形成強(qiáng)凝膠的潛在性質(zhì)［11］。由圖12可知，超聲時(shí)間的長短能有效地影響蛋白的速凝性質(zhì)。超聲時(shí)間為6 min時(shí)，游離巰基含量達(dá)到最高值，二硫鍵含量達(dá)到最低值，作用時(shí)間延長至8 min，蛋白的游離巰基含量和二硫鍵含量與6 min時(shí)相比，沒有顯著的變化。因此，6 min為最優(yōu)的超聲時(shí)間。

圖12 超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白—SH/—S—S—含量的影響Fig.12 Effect of ultrasonic irradiation time on protein —SH/—S—S—

2.4 結(jié)果驗(yàn)證

綜合以上結(jié)果分析，超聲處理改善花生濃縮蛋白功能性質(zhì)的最佳條件為:超聲波功率700 W，超聲時(shí)間6 min。在上述最優(yōu)改性工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到數(shù)據(jù)如表4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在上述條件下超聲處理花生濃縮蛋白，其各項(xiàng)功能指標(biāo)顯著提高，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相似，證明本研究結(jié)果具有可行性和可重復(fù)性。

表4 最優(yōu)工藝下花生濃縮蛋白改性結(jié)果Table 4 Data of modification of peanut protein concentrate at optimal condition

3 結(jié)論

本研究以自制的花生濃縮蛋白為原料，采用超聲波處理方法改善花生濃縮蛋白的功能性質(zhì)。結(jié)果表明，超聲改性的最優(yōu)工藝條件為:超聲功率700 W，超聲處理時(shí)間6 min。在此條件下得到的花生濃縮蛋白產(chǎn)品各項(xiàng)功能指標(biāo)顯著提高:吸水性提高了8.86%，持油性提高了118.11%，乳化性提高了28.67%，乳化穩(wěn)定性提高了107.39%，溶解性提高了69.54%，起泡性提高了133.33%，泡沫穩(wěn)定性 V15提高了222.22%，泡沫穩(wěn)定性V30提高了400.00%，游離巰基含量增加了24.89%，二硫鍵含量減少了28.61%，蛋白最低凝膠點(diǎn)由18%蛋白濃度下降到10%蛋白濃度。超聲波處理能夠顯著改善花生濃縮蛋白的功能性質(zhì)，是一種簡便、有效的蛋白改性方法，適宜工業(yè)應(yīng)用。

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