黃土高原地區釀酒葡萄果實多酚物質及抗氧化活性分析*

蔣寶，羅美娟，張振文

1(渭南職業技術學院，陜西渭南，714000)

2(西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌，712100)

作為釀造葡萄酒的基本原料，葡萄的品質決定著葡萄酒質量的優劣。目前，評價釀酒葡萄果實品質的指標，除常用的總糖、滴定酸、糖酸比和pH值等外，多酚物質也是重要指標之一。多酚作為葡萄果實中一類重要的次生代謝物質，其組成和含量通過影響葡萄原料而進一步影響相應葡萄酒的感官特征，如葡萄酒的色澤、收斂性、苦味和香氣等。此外，這類次生代謝物質還具有重要的保健功能，能減少人體慢性疾病和冠心病的發病率，增強人體的抗氧化損傷能力［1－2］。經研究證實，葡萄酒的抗氧化能力主要取決于其所含有的多酚類物質［3－5］。

葡萄果實中的多酚通常分為黃酮醇、黃烷醇、花色苷、酚酸和萜烯類物質等5大類。然而，即使對于同一葡萄品種而言，葡萄果實中多酚物質的種類和含量因生態條件、栽培方式等不同而有不同程度的差異［6］，從而最終影響到葡萄酒的質量。研究葡萄果實(釀酒原料)中多酚物質的種類及其含量，對科學評價葡萄原料和葡萄酒質量及釀酒工藝的實施具有重要的理論與實際意義。

山西省鄉寧縣地處晉西黃土高原地區，以其具備發展葡萄產業獨特的氣候條件和地域特點被業內專家公認為葡萄栽培的優生區，但該地區葡萄果實中多酚物質及抗氧化活性的研究尚屬空白。為此，本研究選取該地區主栽釀酒葡萄品種蛇龍珠(Cabernet Gernischt)和霞多麗(Chardonnay)，通過光譜和色譜分析，對其葡萄果實中的多酚物質組成、含量及抗氧化活性進行評價，以期為黃土高原地區葡萄酒產業的進一步發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試品種為蛇龍珠和霞多麗，根據葡萄果實的糖酸比值確定其最佳技術成熟度，并于2010年10月前后采收葡萄。2個品種的葡萄果實均采自山西省鄉寧地區(戎子酒莊)且具有代表性的葡萄園。2個品種于2007年定植，均為實生根系，株行距為1.0 m×2.5 m、多主蔓扇形整枝，所有試驗點栽培管理措施完全相同，用GPS測定葡萄園的海拔及經緯度(見表1)。

1.2 實驗試劑

葡萄糖、酒石酸、沒食子酸、NaNO2和AlCl3等，購自天津市博迪化工有限公司;甲醇、甲酸、乙腈、乙酸均為色譜純，購于 Fisher(Fairlawn，NJ，USA)公司;標樣兒茶素((+)-catechin)、槲皮素(quercetin)、白藜蘆醇(trans-resveratrol)、沒食子酸(gallic acid)和咖啡酸(caffeic acid)及二甲氨基肉桂醛(p-DMACA)、2，2-二苯代苦味酞基苯肼(DPPH)和水溶性維生素E(Trolox)，均購自Sigma-Aldrich公司。

1.3 主要儀器設備

UV-1800紫外可見光分光光度計，日本島津公司;Eppendorf 5804R低溫冷凍離心機，德國Eppendorf公司;Agilent 1200高效液相色譜儀-質譜(HPLCMS)，美國Agilent公司。

1.4 樣品采集與提取液制備

采用“S”形取樣法采集葡萄，將所采果實樣品分為2份，1份直接破碎取汁，用于果實總糖、總酸和pH值的測定;另1份葡萄果實用液氮冷凍后研磨成粉末，再用酸化甲醇［V(體積分數60%甲醇)∶V(鹽酸)=100∶0.1］重復提取3次，所有試驗步驟均在避光條件下進行［7］，提取液置于－40℃超低溫冰箱中用于酚類物質及抗氧化活性的測定。

1.5 測定項目及方法

1.5.1 基本理化指標的測定

總糖(以葡萄糖計)采用斐林試劑滴定法測定;總酸(以酒石酸計)用指示劑法(國標法)測定;pH值用酸度計法測定;單寧用福林-丹尼斯法測定［8］。

1.5.2 葡萄酒中酚類物質的測定

總酚含量采用福林-肖卡法［9］測定，結果以每千克果實中含有的沒食子酸表示;總類黃酮的含量采用NaNO2-AlCl3法［10］測定，總黃烷醇的含量采用DMACA法［11－12］測定，結果均以每千克果實中含有的兒茶素表示;總花色苷的含量采用pH值示差法［13］測定，結果以每千克果實中含有的二甲花翠素-3-葡萄糖苷表示。

1.5.3 葡萄酒抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參考Brandwilliams等［14］的方法，銅離子還原能力的測定參考 Apak等［15］的方法，結果均以每千克葡萄果實中所含的Trolox表示。

1.5.4 葡萄果皮中非花色苷酚類物質的測定

葡萄果實中單體酚的定性和定量分析在中國農業大學食品科學與工程學院葡萄與葡萄酒研究中心完成。利用HPLC-MS/MS技術，結合離子的保留時間來進行定性分析［16］。分別以兒茶素、槲皮素、沒食子酸、咖啡酸和白藜蘆醇作為黃烷醇類、黃酮醇類、羥基苯甲酸類、羥基肉桂酸和萜烯類物質的標準物，并利用外標法結合標準曲線的方法進行定量計算。

1.6 數據分析

采用SPSS16.0分析軟件對實驗數據進行分析，非花色苷酚類物質的測定重復測定2次，結果以2次測定的均值表示，其他指標均重復測定3次。

2 結果與討論

2.1 葡萄果實理化指標的分析

鄉寧產區位于晉西黃土高原地區，平均海拔1 050～1 100 m，四季分明，屬于典型的大陸性季風氣候。該產區1月份(最冷月)平均氣溫－6℃，年平均氣溫9.9℃，≥10℃有效積溫2 998℃，較高的海拔為葡萄的生長提供了充足的光照和較大的晝夜溫差。

表1 葡萄果實的基本理化指標Table 1 The physical and chemical index of grape berries

由表1可以看出，2010年該產區蛇龍珠和霞多麗果實的總糖含量分別為196.5和185.3 g/L，相應的糖酸比分別為18.9和21.3。查閱當地氣象資料，2009和2010年該產區7～9月份總降雨量分別為213.6和290.4 mm，2010年比上一年降雨量增加了26.4%，葡萄成熟期間過量的降水在一定程度上限制了果實的成熟度。盡管如此，2個品種在2010年果實的總糖含量均已接近200 g/L，糖酸比接近或超過20，表明其成熟度均良好。

2.2 葡萄果實多酚含量及抗氧化活性的分析

酚類物質含量豐富的葡萄原料是釀造高品質葡萄酒的重要條件。由表2可以看出，紅色品種蛇龍珠果實中單寧、總酚、總類黃酮和總黃烷醇等的含量均高于白色品種霞多麗，這與前人研究結果一致［17］，所以由紅色品種的葡萄原料釀造的葡萄酒具有更強的健康屬性。

蛇龍珠和霞多麗果實的總酚含量分別為2 598.3和1 380.0 mg/kg，均明顯低于蔣寶等［18］在同等條件下對該產區赤霞珠果實總酚含量的研究(赤霞珠為3 445 mg/kg)，究其原因可能在于品種不同所致;此外，該產區霞多麗果實總酚含量明顯低于王睿等［19］在同等條件下對煙臺產區的研究結果，說明溫度和降雨量對葡萄果實品質的影響不可忽視。類黃酮物質是葡萄果實和葡萄酒中含量最高、成分較為復雜的一類多酚物質，也是與葡萄酒感官質量關系最為密切的物質。由表2可知，蛇龍珠和霞多麗果實中總類黃酮含量分別為2 092.4和1 104.6 mg/kg，后者的含量約為前者的50%。黃烷醇對葡萄酒的收斂性具有重要作用，目前公認的具有明顯抗氧化活性的兒茶素就屬于此類。本研究中，蛇龍珠和霞多麗果實的總黃烷醇含量分別為473.1和169.4 mg/kg。其中，蛇龍珠果實的總黃烷醇含量高出同等條件下該產區赤霞珠果實25%以上［18］，研究表明總酚含量高的葡萄果實，其總黃烷醇含量未必也高。葡萄酒中的花色苷物質主要源于葡萄果皮，故白色霞多麗品種的果實中幾乎不含有花色苷。花色苷作為葡萄果皮中的呈色物質，其含量主要取決于品種，但生態條件對果皮中花色苷物質的代謝合成能產生重要影響。本研究中，蛇龍珠果實的花色苷含量為1 591.9 mg/kg。通常高海拔、強光、低溫及較大的晝夜溫差均有利于果皮中花色苷的不斷積累［20］。

表2 葡萄果實的酚類物質含量及抗氧化活性Table 2 Total amount of polyphenolic substances and antioxidant activity of grape berries

2種抗氧化指標的測定結果均表明，蛇龍珠果實的抗氧化活性強于霞多麗，這與蛇龍珠果實含有較高的多酚物質相對應，再次證明葡萄的抗氧化能力主要取決于其所含有的多酚類物質。在DPPH法測定中，蛇龍珠和霞多麗果實的抗氧化能力分別為9 955.7和5 446.1 μmol/kg，前者高出后者45.3%;在 CUPRAC法測定中，蛇龍珠和霞多麗果實的抗氧化能力分別為35 345.2和13 061.4 μmol/kg，前者高出后者63.0%，所以選用的抗氧化測定方法不同，導致測定結果的差異程度不盡相同。

生物體中存在多個抗氧化系統，如抗氧化酶系統、激素和多酚等，它們的工作原理及彼此間的關系尚不清楚［21］。同時，在生物體內存在多種自由基和抗氧化劑資源，它們各自都有不同的物理和化學特征，因此生物體抗氧化活性的評定是件十分復雜的工作，通常需要將2種以上且抗氧化機理不同的方法結合起來，并對選用方法進行優化以此來提高測定結果的客觀性。本研究選用了2種方法，測定結果進一步證實了不同方法間的協同性與差異性。

圖1 葡萄果皮的非花色苷酚類液相色譜圖Fig.1 The HPLC analysis of grape skins non-anthocyanins phenolics

2.3 葡萄果實非花色苷單體酚的分析

葡萄酒中多酚物質的組成首先取決于釀酒原料(葡萄果實)，其次受釀造工藝和陳釀條件的影響。Downey等［20］的研究表明，品種和生態環境不同程度地對葡萄果實中類黃酮物質的生物合成產生影響。為進一步探究該產區蛇龍珠和霞多麗原料中多酚類物質的組成和含量，本實驗通過高效液相色譜法(HPLC-ESI-MS/MS)在2個品種中分別檢測出25和12種非花色苷酚類物質，其中包括6種黃烷醇、13種黃酮醇、5種羥基苯甲酸和1種羥基肉桂酸物質。色譜圖見圖1。

由表3可知，蛇龍珠和霞多麗果實中黃烷醇總量分別為617.8和165.8 mg/kg，且棓兒茶素和表兒茶素僅在蛇龍珠中被檢測出。2個品種的兒茶素含量分別為88.3和42.1 mg/kg，蛇龍珠高出霞多麗約50%，這可能是其具有較強抗氧化活性的重要原因。黃酮醇是一類黃顏色的物質，它們可以保護植物免受紫外線輻射［22］。由表3可知，蛇龍珠和霞多麗果實中分別檢測出13和6種黃酮醇，且彼此間組成和含量均差異較大。在霞多麗果實中檢出的6種黃酮醇，包括4種槲皮素和2種山奈酚。除品種因素外，Price等［23］的研究還表明，光照強度與葡萄果實中黃酮醇的含量存在正相關性。葡萄果實中含有羥基苯甲酸和羥基肉桂酸2類酚酸。在蛇龍珠和霞多麗果實中分別檢測出6和2種酚酸，后者中的酚酸包括香草酸己糖酯和反式-肉桂酸，它們的含量分別為6.6和1.3 mg/kg。由于本研究所用實驗原料的生態條件和田間管理措施完全相同，所以表3中蛇龍珠和霞多麗果實在非花色苷酚類物質組成和含量上的差異主要是由于品種因素的不同所造成的。

3 結論

(1)紅色品種蛇龍珠果實中的總酚、總類黃酮、總黃烷醇和總花色苷均不同程度地高于白色品種霞多麗，所以由紅色品種葡萄原料釀造的葡萄酒具有更強的健康屬性。

(2)DPPH法和CUPRAC法的測定結果均表明:蛇龍珠果實的抗氧化能力高于霞多麗品種，但因選用方法的不同，導致測定結果在不同方法間存在協同性與差異性。

(3)品種因素對蛇龍珠和霞多麗果實中非花色苷單體酚物質的組成和含量造成不同程度的影響，尤其是兒茶素含量前者是后者的2倍。

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