褪黑素通過抑制ROS改善胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝

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·基礎醫學·

褪黑素通過抑制ROS改善胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝

佘美華，蔣文艷，張瑤，楊娟，尹衛東
(南華大學藥學與生物科學學院生物技術系，湖南 衡陽 421001)

目的探討褪黑素(MLT)對胰島素抵抗(IR)HepG2細胞葡萄糖代謝的影響及機制。方法培養HepG2細胞，高糖高胰島素(25 mmol/L葡萄糖、1 μmol/L胰島素)誘導24h，建立IR細胞模型并給予MLT(1 nmol/L,10 nmol/L)處理。葡萄糖氧化酶法、蒽酮法和熒光探針法檢測HepG2細胞的糖攝取、糖原含量及活性氧(ROS)產率。結果HGI孵育HepG2細胞24 h后，細胞的葡萄糖攝取及糖原含量明顯減少(P<0.01)，ROS產率顯著增加(P<0.01)；而MLT處理增加了IR細胞葡糖糖的攝取(P<0.01)和糖原合成(P<0.05)，降低ROS的水平(P<0.01)。結論MLT可能通過抑制ROS的生成而改善氧化應激，從而促進胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖的攝取和利用、增強其胰島素敏感性。

褪黑素； 胰島素抵抗； 葡萄糖攝取； 糖原； ROS

褪黑素(melatonin,MLT)是大腦松果體腺合成和分泌的一種吲哚類神經內分泌激素，具有調節晝夜節律的作用。近年來研究表明褪黑素參與維持機體葡萄糖穩態和改善胰島素敏感性[1]。如實施松果體切除術后的大鼠葡萄糖耐受不良、胰島素敏感性下降，而外源性補充MLT則能逆轉這一狀態[2]。Agil等[3]發現MLT能降低T2DM模型大鼠的高胰島素血癥和HOMA-IR。由于胰島素抵抗(IR)的發生與氧化應激密切相關，氧化應激狀態下ROS生成過多或清除不足，誘發細胞膜脂質過氧化，并且它還能通過多條應激敏感性信號通路影響基因表達和損傷細胞[4]，最終影響細胞的正常代謝。基于MLT、氧化應激以及胰島素抵抗之間的聯系，本實驗將探討MLT是否通過改善氧化應激來改善胰島素抵抗。

1 材料與方法

1.1 材料來源

HepG2細胞購于北京協和細胞資源中心；MLT由以色列Neurim Pharmaceuticals公司提供，DMSO溶解后用DMEM稀釋至工作濃度(DMSO終濃度低于0.01%)；胰島素(INS)、胎牛血清(FBS)均購于Sigma公司。

1.2 細胞培養與分組處理

HepG2細胞于37°C、5% CO2飽和濕度條件下，10% FBS的L-DMEM中培養，觀察細胞生長情況，細胞融合后進行傳代，轉入6孔板，待貼壁生長后，分正常對照組，其余為胰島素抵抗模型組。正常對照組(IS組)以含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液培養；模型組則以含高糖高胰島素(25 mmol/L葡萄糖和1 μmol/L胰島素)的DMEM培養液培養24 h，再用含或不含MLT(1 nmol/L、10 nmol/L)的DMEM培養液繼續培養6 h。

1.3 葡萄糖消耗實驗

按照GOD-POD試劑盒(上海榮盛生物藥業有限公司)，將上述各組細胞分別給予有無100 nmol/L胰島素刺激6 h后，用葡萄糖氧化酶法檢測培養液中的葡萄糖含量，以未接種細胞空白復孔的糖含量均值相減，算出各孔細胞的葡萄糖攝入量。

1.4 細胞內糖原含量檢測

按照糖原含量檢測試劑盒(南京建成)，采用葸酮法檢測上述細胞中的糖原含量。按說明將細胞消化下來，離心沉淀并加入300 μL堿液，雙蒸水定容至500 μL，加顯色液，沸水浴5 min，冷卻后在620 nm波長下比色測定。

1.5 細胞內ROS含量檢測

按照活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)，采用DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞內ROS的含量。先去除培養液，無血清DMEM洗滌，加入DCFH-DA工作液并孵育20 min；去除工作液，用預熱PBS洗3次；常規消化收集細胞，PBS洗滌3次，反復吹打成單細胞懸液，用熒光分光光度計(488 nm激發波長，525 nm發射波長)檢測熒光強度。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 MLT改善高糖高胰島素誘導HepG2細胞胰島素抵抗

基礎狀態下，各組細胞的葡萄糖攝入無明顯差異。在胰島素存在條件下，IS組細胞對葡萄糖攝入量明顯增加，為基礎狀態下的1.78倍(P<0.01)；高糖高胰島素處理后HepG2細胞(單純IR細胞組)，其胰島素介導的葡萄糖攝入量顯著低于IS組，下降29%(P<0.01)，說明高糖高胰島素誘導發生胰島素抵抗；而對胰島素抵抗細胞進行MLT處理后，其胰島素介導的葡萄糖攝入明顯增加(P<0.01)。

圖1 MLT對HepG2細胞胰島素抵抗模型糖消耗的影響1：IS；2：IR；3：1 nmol/L MLT；4：10 nmol/L MLT. 與基礎狀態葡萄糖攝入相比，*：P<0.01；胰島素介導的葡萄糖攝入，與IS組相比，#：P<0.01；與IR組相比，&：P<0.01，n=3

2.2 MLT對HepG2細胞胰島素抵抗模型糖原含量的影響

與正常對照HepG2細胞相比，高糖高胰島素誘導IR組細胞糖原含量減少約85%(P<0.01)；而對該IR模型細胞進行MLT處理，其糖原含量增加3倍以上(P<0.05)(圖2)，提示MLT促進了高糖高胰島素誘導細胞的糖原的合成。

2.3 MLT對胰島素抵抗HepG2細胞ROS含量的干預作用

與正常對照HepG2細胞相比，高糖高胰島素誘導的IR組細胞ROS增加明顯，增加0.42倍(P<0.01)，MLT(1 nmol/L,10 nmol/L)處理后的IR模型細胞ROS無顯著性差異。與IR組比較，低高濃度MLT處理組細胞ROS則顯著減少，分別減少約27%和31%(P<0.01)。低高濃度MLT處理組相比，無顯著性差異(圖3)。

圖2 MLT對HepG2細胞胰島素抵抗模型糖原的影響1：IS；2：IR；3：1 nmol/L MLT；4：10 nmol/L MLT 與IS組相比，**：P<0.01，*：P<0.05；與IR組相比，#：P<0.05，n=3

圖3 MLT對HepG2細胞胰島素抵抗模型ROS的影響1：IS；2：IR；3：1 nmol/L MLT；4：10 nmol/L MLT 與IS組相比，*：P<0.01；與IR組相比，#：P<0.01，n=3

3 討 論

肝臟是胰島素發揮作用的主要靶器官之一，肝細胞糖代謝的紊亂對胰島素抵抗的發生具有十分重要意義。胰島素抵抗時，糖代謝紊亂，糖攝取能力減弱和肝糖原合成減少，導致血糖升高。本研究通過高糖高胰島素成功誘導HepG2細胞發生IR，表現為對葡萄糖攝取減少，同時細胞內糖原合成降低，提示高糖高胰島素抑制了細胞對葡萄糖的利用能力。

最近研究表明，反應活性氧與胰島素抵抗的發生發展密切相關[5-7]。ROS是一類具有強氧化性的含氧物質的總稱，主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH·)、過氧化氫(H2O2)和脂質過氧基(ROO·)等，它不僅可以直接氧化體內生物活性大分子如蛋白質、脂質及核酸等而使細胞受損，而且能夠行使第二信使信號分子功能激活各種應激激酶，活化多條氧化應激敏感性信號通路，干擾細胞胰島素信號轉導，導致胰島素抵抗。在活性氧介導的氧化應激狀態下，3T3-L1脂肪細胞胰島素受體底物(IRS-1)和(IRS-2)絲氨酸殘基磷酸化，進而下調IRS-1的表達，導致胰島素抵抗[6]。Evans等[7]發現高糖所致的ROS是通過激活AGES、NF-κB及PKC等途徑導致胰島素抵抗的。Houstis等[8]用地塞米松和TNF-α處理細胞，發現細胞內ROS產生增加，而應用抗氧化藥物降低ROS水平后IR得到改善。可見清除活性氧的含量，有助于改善胰島素抵抗。本研究發現高糖高胰島素培養顯著增加了HepG2細胞ROS含量，推測ROS是高糖高胰島素誘導發生胰島素抵抗的重要因素。

褪黑素是大腦松果體腺合成分泌的一種吲哚類神經內分泌激素，除具有改善睡眠，改善免疫功能以外，還具有強效的抗氧化性，它可以直接清除自由基、減少自由基的生成，提高抗氧化酶的活性等。

本研究發現褪黑素顯著增加了其胰島素刺激的葡萄糖攝入和糖原的合成，同時ROS減少了含量。提示MLT通過降低ROS水平改善氧化應激狀態，從而促進了高糖高胰島素培育HepG2細胞對葡萄糖的利用率，改善胰島素抵抗。

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[3] Agil A,Rosado I,Ruiz R,et al.Melatonin improves glucose homeostasis in young Zucker diabetic fatty rats[J].Pineal Res,2012,52(2):203-210.

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MelatoninAmelioratesGlucoseMetabolismviaInhibitingROSGenerationinInsulinResistantHepG2CellsInducedbyHighGlucoseandInsulin

SHE Meihua,JIANG Wenyan,ZHANG Yao,et al
(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofPharmaceuticalandBiologicalScience,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effects of melatonin on glucose metabolism in high glucose and insulin-induced insulin resistant HepG2 cells.MethodsInsulin resistant HepG2 cells were induced by high glucose and insulin (HGI,25 mmol/L and 1 μmol/L respectively) coculture for 24 h,and then melatonin was added.The uptake of glucose was measured by glucose oxidase method,anthrone method was used to detect the Glycogen synthesis and fluorescence probe was used to detect ROS production.ResultsHGI incubating led to significant decreases in insulin-stimulated glucose uptake and glycogen synthesis in HepG2 cells (P<0.01),but ROS production increased (P<0.01).However,MLT treatment reversed the above state by increasing glucose uptake (P<0.01) and glycogen synthesis (P<0.05),inhibiting the generation of ROS(P<0.01).ConclusionsMLT could improve oxidative stress by inhibiting the production of ROS,and thereby increase glucose utilization and improve insulin sensitivity of insulin resistance HepG2 cells.

MLT; insulin resistance; glucose uptake; glycogen; ROS

2095-1116(2014)05-0433-03

2014-03-06

國家自然科學基金(81200590)；高等學校博士學科點專項科研基金(20124324120005).

佘美華，博士，副教授，研究方向：糖尿病的分子機制研究，E-mail：shemhbb@163.com，通信作者尹衛東，教授，博士生導師，研究方向：糖尿病的分子機制研究，E-mail：wdy20042004@126.com.

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(此文編輯：秦旭平)