維拉帕米阻抑UUO大鼠腎間質纖維化

，， (南華大學附屬第一醫院腎內科，湖南 衡陽 421001)

維拉帕米阻抑UUO大鼠腎間質纖維化

萬青松，謝紅萍，楊波
(南華大學附屬第一醫院腎內科，湖南 衡陽 421001)

目的探討維拉帕米對單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質纖維化的影響。方法將24只大鼠隨機分為對照組(即假手術組)、UUO模型組、維拉帕米治療組，采用單側輸尿管梗阻模型，術后8天觀察梗阻腎組織病理改變，比色法測定腎組織羥脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,并應用放射免疫法檢測血漿和腎組織內皮素-1(ET-1)的含量。結果與對照組比較，模型組腎組織HYP和MDA含量明顯升高，血漿和腎組織內皮素-1含量明顯升高，腎組織SOD含量顯著下降(P<0.01),維拉帕米治療組與模型組相比，腎組織HYP和MDA含量明顯下降，血漿和腎組織內皮素-1下降，腎組織SOD含量顯著升高，差異均有顯著性(P<0.05)。結論維拉帕米能減少單側輸尿管梗阻大鼠脂質過氧化物的產生，降低血漿和腎組織內皮素-1的含量，增加抗氧化酶的含量，從而阻抑UUO大鼠腎間質纖維化。

腎間質纖維化； 氧化應激； 內皮素-1； 維拉帕米

幾乎所有慢性進行性腎臟疾病都是纖維化破壞過程的結果，由于腎間質纖維化的程度與腎功能受損的程度密切相關，單側輸尿管梗阻(unilateal ureteral obstruction,UUO)是研究腎間質纖維化的經典模型[1]。研究表明氧化應激參與腎間質纖維化的形成[2]。維拉帕米可通過舒張血管平滑肌，改善腎臟灌注，抑制黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶轉化而具有抗氧化應激作用[3]，在醫學研究中，維拉帕米對于順帕誘導的腎毒性有保護作用[4]，在臨床腎移植實踐中，維拉帕米可拮抗免疫抑制劑的腎毒性，因此，探討維拉帕米對腎間質纖維化的影響，對于延緩慢性腎功能衰竭的進程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SD大鼠(南華大學動物實驗中心提供)24只，雌性，體重210±30 g，隨機分為3組：對照組、模型組、維拉帕米治療組，每組大鼠為8只。

1.2 主要試劑及藥物

維拉帕米(也稱異博定)，哈藥集團制藥四廠生產，批號：H23020197。組織羥脯氨酸(Hydoxyl puamino acid，HYP)、丙二醛(Malondiadehyde，MDA) 、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)購于南京建成生物工程研究所。內皮素-1(Endothelin-1，ET-1)放射免疫測試盒購自北京北免東雅生物技術研究所。

1.3 UUO模型建立

在無菌條件下將24只大鼠腹腔注射氯氨酮(50 mg/kg)，背部腎區開腹后結扎左側腎下極輸尿管，縫合腹腔，即制備UUO模型，對照組不結扎輸尿管，其余操作同上。術前24 h、術后每日、維拉帕米組予維拉帕米(每天0.5 mg/kg)混懸液2 mL灌胃，對照組、手術組予2 mL生理鹽水灌胃。術后第8天，每組處死8只大鼠取左側腎臟。

1.4 腎組織病理檢查

腎組織縱切，一部分用于放免測ET-1，另一部分10%中性甲醛固定，經梯度酒精脫水、石蠟包埋，組織切片4 μm，作HE、Masson染色。

1.5 腎組織羥脯氨酸(HYP)含量測定

精確稱取腎組織濕重100 mg放入試管中，按照試劑盒說明操作，用721分光廣度計，在波長為550 nm光波下比色，測定前制備羥脯氨酸標準液及空白對照。

1.6 MDA、SOD測定

用預冷的0.85%生理鹽水裂解腎組織，制成10%和1%勻漿，比色法分別測定腎組織MDA含量及總SOD活性，按試劑盒說明書操作。

1.7 血漿、腎組織ET-1放免測定

取出活腎組織，吸去血跡稱取100 mg，盡快放入1 mol/L醋酸1 mL略做碾磨，然后在100 ℃水浴中煮沸10 min，勻漿。4 ℃ 3 000 rpm離心15 min，取上清液0.5 mL，-20 ℃以下保存，測定時用PBS五倍稀釋。取靜脈血1 mL，注入含10%EDTA二鈉3 μL和抑肽酶40 μL的試管中，混勻，4 ℃ 3 000 rpm離心10 min，分離血漿，取上清液0.5 mL，-20 ℃以下保存，測定前，使樣本在室溫中復融，再次4 ℃ 3 000 rpm離心5 min，取上清0.2 mL。用放射免疫平衡法檢測上述上清液ET-1含量。

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 一般形態學改變

HE染色和Masson染色結果：模型組病理片表現腎小管上皮萎縮，腎小管腔擴張，間質炎癥細胞浸潤，成纖維細胞增生，間質纖維化，維拉帕米治療組也有以上表現，但炎癥細胞、成纖維細胞數量較模型組少。對照組腎臟膠原染色主要位于腎小管肌膜、腎小囊、系膜區和腎小管間的毛細血管周圍，腎小管間質染色較少，而模型組腎小管間質染色較對照組明顯增強，維拉帕米治療組腎小管間質染色較對照組增強，但較模型組明顯降低(圖1)。

圖1 各組HE染色及Masson染色(×200)

2.2 3組羥脯氨酸、MDA和SOD含量比較

與對照組大鼠腎組織HYP含量(0.39±0.14 μg/mg)比較，模型組大鼠腎組織HYP含量(0.69±0.17 μg/mg)顯著升高(P<0.01),維拉帕米治療組大鼠腎組織HYP含量(0.47±0.13 μg/mg)較模型組明顯降低(P<0.05)。與對照組比較，模型組腎組織MDA含量顯著升高(P<0.01)，而抗氧化酶SOD含量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，維拉帕米治療組MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD含量顯著升高。見表1。

表1各組大鼠腎組織HYP、MDA和SOD含量的變化

組別nHYP(μg/mg)MDA(nmol/mgprol)SOD(U/mgprol)對照組80．39±0．141．72±0．34291．24±45．34模型組80．69±0．17a3．56±0．23a182．35±29．42a維拉帕米組80．47±0．13b2．50±0．47b221．77±39．72b

與對照組比較,a:P<0.01；與模型組比較，b:P<0.05

2.3 血漿和腎組織ET-1的檢測

模型組血漿和腎組織ET-1的含量與對照組相比顯著增高(P<0.01)，維拉帕米治療組與模型組相比則顯著減少(P<0.05)。見表2。

表2大鼠血漿及腎組織ET-1含量變化

組別n血漿ET?1(pg/mL)腎組織ET?1(pg/100mg)對照組839．8±7．13297．8±23．3模型組866．2±10．37a506．4±39．2a維拉帕米組850．7±6．16b392．5±11．8b

與對照組比較,a:P<0.01；與模型組比較,b:P<0.05

3 討 論

腎間質纖維化是多種慢性腎臟疾病發展的共同結局，UUO模型是目前常用的腎小管損傷模型之一，腎間質纖維化時，腎組織內膠原纖維量增加，由于HYP為膠原纖維所特有，故常作為判斷纖維化程度的指標[5]。本文模型組大鼠UUO后8天梗阻腎病理呈現腎間質纖維化，HYP含量顯著高于對照組，而維拉帕米組腎間質纖維化較模型組輕，HYP含量顯著低于模型組，證明維拉帕米可阻抑腎間質纖維化。

目前認為，UUO模型腎臟病理損傷與腎缺血、低氧、血管緊張素Ⅱ、轉化生長因子β1、活性氧等產物誘發的損傷有關。脂質過氧化使細胞膜完整性破壞，引發細胞周圍炎癥，丙二醛(MDA)是在氧自由基作用下發生脂質過氧化反應的一種產物，其本身也能破壞細胞膜的結構與功能，對細胞具有毒性，并能刺激間質細胞膠原基因表達MDA量的變化提示體內脂質過氧化，間接反映細胞損傷的程度[6]。超氧化物酶(SOD)能清除超氧化物陰離子，可拮抗脂質過氧化，其活力的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力。因此，抑制已產生的自由基及加強抗自由基等方法可作為阻抑腎間質纖維化有效的措施。

Ca2+促進細胞損傷的主要部位在質膜、線粒體、內質網和細胞骨架系統，UU模型大鼠，血漿和腎組織中ET-1的濃度明顯增高，這與本研究一致，ET-1與特異的ET受體結合后，使腎內小動脈出現較持續的收縮反應，還能促進胞內鈣池釋放Ca2+，以及開放鈣通道，使Ca2+大量內流，結果造成鈣超載和細胞壞死，并使腎血流量下降和腎小球濾過率降低。維拉帕米可與細胞膜上鈣通道結合，改變其通透性而阻止細胞外Ca2+內流，并具有血管擴張效應而對抗ET-1的作用[7]，還具有干擾自由基損害的作用，因此可減輕腎間質的損傷?？傊S拉帕米能夠阻抑Ca2+大量內流，從而減少單側輸尿管梗阻大鼠脂質過氧化物的產生，降低血漿和腎組織內皮素-1的含量，增加抗氧化酶的含量，從而阻抑UUO大鼠腎間質纖維化。

[1] 韓紅,孫東,麻艷艷,等.單側輸尿管梗阻模型小鼠腎臟微血管損傷與腎間質纖維化的關系研究[J].中國病理生理雜志，2010,26(12):2478-2481.

[2] 鄒赟，朱煒，邵命海,等.健脾清化方對5/6腎切除大鼠ATⅡ/NADPH氧化應激通路的干預作用[J].中南大學學報,2013,35(8):25-30.

[3] 林宗明，方銀忠，張永康,等.維拉帕米和超氧化物歧化酶對體外沖擊波腎損傷的保護作用[J].中華泌尿外科雜志，2014,24(2):93-95.

[4] 姜華茂,郭敏,張春陽,等.維拉帕米對ESWL所致腎損傷保護作用的實驗研究[J].遼寧醫學院學報,2009,30(5):405-406.

[5] 孫蔚楠,盧釗宇,謝院生,等.氯沙坦對腎間質纖維化的抑制作用[J].中國中西醫雜志,2012,13(5):383-386.

[6] 張曉喧,李銀輝,鄭偉,等.單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化中氧化應激的變化[J].中國現代醫學雜志，2007,17(4):414-417.

[7] Topcu SO,Celik S,Erturhan S，et al.Verapamil prevents the apoptotic and hemodynamic change in response to unilateral ureteral obstruction[J].Int J Urol,2008,15(4):350-355.

Anti-fibrosisEffectofVarapamilonRatKidneywithUnilateralUreteralObstruction

WAN Qingsong,XIE Hongping,YANG Bo
(DepartmentofNephropathy,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of varapamil on kidney of rats with interstitial fibrosis after unilateal ureteral obstruction(UUO).MethodsTwenty-four rats were randomLy assigned to shame operation group(normal group),UUO group and varapamil treatment group after unilateral ureteral obstruction.Renal tissues were examined by light microscopy 8 days after operation.Hyd -roxyl puamino acid (HYP)，Malondiadehyde(MDA) and superoxide dismutase(SOD) content were measured.Endothelin (ET-1) was measured by radioimmunoassay.ResultsIn comparison with shame operation group,HYP and MDA content significantly increased,the level of plasmic and renal endothelin-1 significantly increased,SOD content significantly decreased(P<0.01).In comparison with UUO group,varapamil signicantly ameliorated what had mentioned (P<0.05).ConclusionsVarapamil can suppress renal interstitial fibrosis by reducing lipid peroxidation production and reducing the level of plasmic and renal endothelin-1 and improving antioxidative enzyme contents.

renal interstitial fibrosis； oxidative stress； endothelin-1； varapamil

2095-1116(2014)05-0440-03

2013-12-18

衡陽市科技局課題 (2009 KJ39).

萬青松，碩士，副主任醫師，副教授，研究方向：腎纖維化，E-mail:Wanqs40@sina.com.

R692

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(此文編輯：蔣湘蓮)