一種從廢啤酒酵母中生產β-D-葡聚糖和甘露聚糖的新方法

周 蕊

(陜西國際商貿學院，陜西 咸陽712046)

0 概述

酵母多糖是從酵母細胞壁中提取的大分子碳水化合物的聚合物，主要成分是β-D-葡聚糖和甘露聚糖。β-D-葡聚糖包括（1,3）β-D-葡聚糖與少量的（1,6）連接葡萄糖和其他支鏈[1]。甘露聚糖通常以共價鍵和蛋白質結合，稱為甘露糖蛋白[2]。

β-D-葡聚糖通常稱為生物反應調節劑（BRM）[3]。β-D-葡聚糖可以作為免疫應答，抗癌，造血調控，保肝，降低膽固醇以及降血糖活性[4,5-8]。β-D-葡聚糖也有抗氧化的作用和能會加速傷口愈合的作用[9,10]。細胞壁甘露聚糖也有粘接性能[11]和抗原變異[12]。鑒于多糖以上所有的特性和用途，前人已有很多研究。但是大多數都是β-D-葡聚糖和甘露聚糖單獨提取。我們提出了一個同時生產兩種產品的新方法。這個方法過程簡單，高效和易于轉換到大規模生產。

生產過程見圖1。

圖1 廢酵母中β-D-葡聚糖和甘露聚糖的制備方法

1 實驗

1.1 實驗材料

固體含量為25%廢酵母泥：南京同凱兆業生物技術有限公司提供。酶:沈陽諾維信生物技術有限公司。試劑均為國產分析純。

1.2 分析方法

1.2.1 多糖的含量測定采用苯酚硫酸法-與6%的苯酚濃度測定，于490nm紫外吸收處測定總糖，分別用葡萄糖和甘露糖為標準曲線定量[13]。

1.2.2 蛋白質的測定通過凱氏定氮分析儀測定總氮（福斯特卡托，公司，瑞典）根據AOAC正式方法。由總氮含量乘以6.25計算蛋白質含量。

1.2.3 灰分的測定

干燥后的樣品在600℃焚燒爐中測定灰分（林德伯格/藍色M，美國）[14]。

1.2.4 含鹽量的測定

用硝酸銀滴定法測定鹽，用作指示劑鉻酸鉀。

1.2.5 紅外光譜

β-D-葡聚糖和甘露聚糖紅外光譜分析在Nicolet 380光譜儀中進行（熱電，美國）。樣品KBr壓片近似重量比為1:100[15]。

1.3 過程

1.3.1 預處理

由于廢啤酒酵母漿包含一些雜質和無機離子。預處理是用蒸餾水洗滌混合物（300g）在室溫下以5000 rpm攪動兩次，每次維持10分鐘。每次洗滌后放置在溫度4℃下冰箱中備用。

1.3.2 超聲處理

預處理后的酵母細胞壁是加入0.02M檸檬酸鹽緩沖液（添加堿調整到pH=7.2）得到的懸浮液中固體含量為15%。在室溫下在超聲波細胞破碎儀中（jy92-ⅡDN新芝生物科技有限公司，寧波）進行超聲，程序設計為超聲2s停2s持續10分鐘。

1.3.3 高溫高壓提取

超聲后將懸浮液放入壓力為0.1MPa在高壓蒸汽滅菌器中高壓滅菌90min，溫度為121℃后冷卻到30℃。不溶性殘留物通過離心分離，并將檸檬酸鹽緩沖液與上清液（SUP）結合，存儲在4℃下。沉積物（SED）被用來提取β-D-葡聚糖。

1.3.4 β-D-葡聚糖的提取

（1）堿處理。

通過正交法L9（34）優化提取條件。九種提取物分別在提取溫度為50℃,55℃和60℃，提取時間分別為2h、3h、4h，固液比為1/3，1/4，1/5（W/V）和NaOH濃度為2%，3%，4%下進行。表1顯示了實驗條件為β-葡聚糖的提取啤酒廢酵母泥300g，其中含有78.42%的水分。混合后冷卻到室溫，不溶性殘留物在室溫15min 5000rpm條件下被離心分離，用蒸餾水洗滌兩次。丟棄上清液和收集沉淀物。

表1 正交試驗因素水平

（2）蛋白酶處理

堿處理后用不同的酶酶解，目的是降低蛋白質含量和純化多糖。用水稀釋得到的懸浮液含有15%（W/W）的固體含量。分別用木瓜蛋白酶（P1），復合酶（P2）和中性蛋白酶（N）在各自的最佳條件酶解后，懸浮液5000rpm離心10min。丟棄上清液，收集濕產物。

（3）洗滌和干燥

濕β-D-葡聚糖懸浮在95%乙醇混懸液中攪拌3h，然后離心棄上清。用乙醇沖洗兩遍，在60℃下干燥。

1.3.5 提取甘露聚糖

（1）濃度

在50℃-60℃下，在旋轉蒸發器（re-52，中國上海中國生化儀器廠）超濃縮至原體積的1/2-1/3。完成后溶液冷卻至室溫。

（2）透析

在室溫條件下，對蒸餾水透析適當時間后測定溶液鹽度。

（3）脫水

濃縮的溶液滴加三倍體積的乙醇攪拌，然后儲存在4℃下超過10h。

（4）洗滌和干燥

用乙醇沉淀數次直到上清液透明，甘露聚糖真空過濾，并在60℃下干燥。收集的甘露聚糖是白色無定形粉末。

2 結果與討論

2.1 預處理

預處理會損失去一部分多糖，所以洗兩次是最好的。通過物理或者化學的方法使完整的酵母通過自溶和滲透來提取酵母內容物[14]。葡聚糖和甘露聚糖產量如表2所示。

經過高溫高壓處理，將混合物離心。這個過程可以有效地分離甘露糖蛋白和葡聚糖。此外，高溫高壓處理能顯著降低細胞壁[16]的機械強度，這可能有助于下酶解。

表2 分別處理葡聚糖和甘露聚糖中固體含量和化學成分

表3 正交實驗的設計和結果

2.2 β-D-葡聚糖的分離

2.2.1 堿處理

工藝中氫氧化鈉可以去除一些不需要的成分如蛋白質，脂類和多糖。溫度，提取時間，料液比、NaOH濃度通常被認為是最重要的因素。優化的β-D-葡聚糖提取合適的提取條件可通過正交實驗實現。表3顯示了實驗條件對堿提取結果的影響。因此，表4列出了K，k、R值。

表4 L9(34)實驗結果分析

根據表4中R的數值，以碳水化合物及粗蛋白平均百分比的影響分別是：B＞A＞D＞C，Affgt;Dffgt;Cffgt;B。由于蒸餾水相對便宜，所以增加料液比有助于去除其他雜質，因此，我們選擇C2為適用條件。NaOH濃度（因子）的確定的粗蛋白含量和高濃度堿易造成多糖[17-20]降解，因此適用條件是D2。對于葡聚糖提取過程的最優參數組合為A3B2C2D2。即，提取溫度，提取時間，料液比、NaOH濃度分別為60℃，3h，1/4，和3%。

2.3 甘露聚糖提取

2.3.1 濃度與透析

上清液（SUP）經過高溫高壓處理后收集，在旋轉蒸發器濃縮。由于SUP含有大量的鹽，如果超濃縮過度，鹽從溶液中析出，造成多糖的損失，因此，2-3倍是適當的濃度。

經過蒸餾水透析一段時間，鹽從溶液中滲透到蒸餾水中。以碳水化合物和灰分的含量為評價指標。溶液鹽度和其中碳水化合物和灰分含量的產品之間的關系如圖2所示。

圖2 透析過程中鹽度對碳水化合物和灰分含量的影響

圖3 葡聚糖（G）和甘露聚糖（M）的紅外圖譜

根據分析，隨著鹽度的降低，碳水化合物和蛋白質都相應增加，灰分減少，即在產品中的活性成分增加。如圖所示，灰分隨著鹽度的變化不斷減少。但是，鹽度的變化從1.81%到0.06%，9h內灰分下降僅為0.17%，不利于工業化發展。因此，溶液的適宜鹽度為0.8%～1.2%。

2.4 產物定性

2.4.1 紅外檢測

在3384cm-1/3397cm-1，2932cm-1/2922cm-1，1644cm-1/1637cm-1處有明顯的吸收帶，分別是-OH，C-H鍵和C=O拉伸吸收峰。在1200cm-1-950cm-1的是C-O振動吸收峰。最重要的約891cm-1處的吸收帶說明葡聚糖是β-構型，845cm-1處是α-吡喃環[21]端基異構體形式。在811cm-1和912cm-1處的特殊吸收說明M是α-甘露聚糖[22]，這從他們的單體單元和葡聚糖的特征譜帶在1157cm-1，1078cm-1，1040和891cm-1處，這表明鏈接為β構型。因此，說明產物是β-D-葡聚糖和α-甘露聚糖。如圖3所示。

3 結論

新方法在超聲處理后采用高溫高壓法分離β-D-葡聚糖和甘露聚糖。β-D-葡聚糖通過堿處理和蛋白酶降解法純化，而甘露聚糖的制備則通過以下步驟包括濃縮、透析、沉降制備。此外，還驗證了濃縮液鹽度和多糖、灰分和沉降速率的關系，最終確定了整個工藝的最優鹽度。

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