飼糧添加膽堿對鵝免疫性能和肝臟組織學的影響

張文旭 王寶維 毛 珂 葛文華 張名愛 李文立

(青島農業大學動物科技學院1，青島 266109)(青島農業大學優質水禽研究所2，青島 266109)(青島蔚藍生物集團有限公司3，青島 266061)

飼糧添加膽堿對鵝免疫性能和肝臟組織學的影響

張文旭1王寶維2毛 珂3葛文華2張名愛2李文立1

(青島農業大學動物科技學院1，青島 266109)(青島農業大學優質水禽研究所2，青島 266109)(青島蔚藍生物集團有限公司3，青島 266061)

研究飼糧中添加不同水平膽堿對鵝免疫性能和肝臟組織學的影響。選用1日齡青農灰鵝180只，隨機分為6個處理，每處理3重復，每重復10只。在玉米-豆粕型飼糧中分別添加0、600、1 200、1 800、2 400和3 000 mg/kg的膽堿。試驗期15周。結果表明：1) 飼糧中添加膽堿能顯著提高4、15周齡鵝免疫器官指數(P<0.05或P<0.01)，但對血清禽流感抗體效價無顯著影響(P>0.05)。2) 飼糧未添加膽堿組鵝肝臟細胞腫大，胞漿內有較多大小不等的脂肪空泡，將細胞核擠壓到一側，添加1 200～3 000 mg/kg膽堿均可有效改善肝臟內脂肪的沉積現象。綜合衡量各項指標，在飼糧中添加膽堿是可行的，膽堿添加水平均1 200 mg/kg為宜。

膽堿 鵝 免疫性能 肝臟組織學

膽堿(choline)是人和動物所必需的水溶性維生素，廣泛分布于動植物組織中，具有重要的生理功能。膽堿是構成細胞膜磷脂和神經遞質乙酰膽堿的組成成分，在維持細胞正常結構和功能，參與機體脂肪代謝，防止肝臟脂肪異常蓄積等過程中起著重要作用，同時還是生物體中重要的甲基供體[1-3]。Best等[4]發現，對大鼠飼喂低膽堿高脂肪的飼糧，補加膽堿后可阻止其誘發脂肪肝，證明膽堿是抑制肝臟脂肪沉積中卵磷脂的活性因子。研究表明，飼糧中添加適當膽堿顯著降低肉仔雞肝重和腹脂率，有效減少肝臟脂肪積累[5-7]。膽堿缺乏可導致Wistar大鼠肝細胞線粒體功能紊亂，發生脂質過氧化反應，引起細胞凋亡，造成氧化損傷[8-9]。Tsiagbe等[10]研究發現，日糧添加膽堿對肉仔雞免疫反應無顯著影響。迄今為止，家禽膽堿營養的研究主要集中在雞、鴨等禽類，而鵝膽堿營養的研究報道較少，尤其鮮有膽堿對鵝免疫性能及肝臟組織學影響的相關報道。同時國內關于膽堿在鵝飼糧中的適宜添加量鮮見報道。因此，本試驗以青農灰鵝為對象，研究不同水平膽堿對鵝免疫性能及肝臟組織學影響，旨在探討膽堿對鵝免疫性能和脂質代謝的影響機制，為豐富我國鵝維生素營養研究數據，制訂鵝的飼養標準提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與基礎飼糧

氯化膽堿：山東恩貝集團有限公司(氯化膽堿質量分數≥50%)。試驗鵝基礎飼糧以玉米和豆粕為主要原料，參照NRC(1994)家禽營養需要量中推薦的鵝飼糧營養水平設計配方[11]。全期分為0～4周齡，5～15周齡2個飼養階段，2階段基礎飼糧中膽堿含量分別為920和911 mg/kg，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

表1(續)

注：多維和微量元素為每kg飼糧提供 ：1～4周齡,VA 1 500 IU，VD3200 IU，VE 12.5 mg，VK31.5 mg，VB12.2 mg，VB25.0 mg，煙酸 65 mg，D-泛酸 15 mg，VB62 mg，生物素 0.2 mg，葉酸 0.5 mg，Fe 90 mg，Cu 6 mg，Mn 85 mg，Zn 85 mg，I 0.42 mg，Se 0.3mg。5～15周齡,VD3200 IU，VE 12.5 mg，VK31.5 mg，VB12.2 mg，VB25.0 mg，煙酸 65 mg，D-泛酸15 mg，VB62 mg，生物素 0.2 mg，葉酸 0.5 mg，Fe 85 mg，Cu 5 mg，Mn 80 mg，Zn 80 mg，I 0.42 mg，Se 0.3mg。 營養水平為計算值。

1.2 試驗動物及設計

選擇1日齡青農灰鵝180只，隨機分為6個處理，每個處理3個重復，每個重復10只鵝。分別在6個處理組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ)的基礎飼糧中添加0、600、1 200、1 800、2 400和3 000 mg/kg的膽堿，試驗期為2011年5月18日至9月1日，共15周。

1.3 飼養管理

試驗鵝自由飲水和采食，全期舍飼，自配粉狀混合料，少喂勤添。育雛期隨時調節育雛溫度：育雛前3周齡溫度分別為28～30 ℃、26～27 ℃、24～25 ℃，3周齡后逐漸降到常溫。1～2周齡光照23 h；3周齡光照18 h；4～15周齡采用自然光照。平均相對濕度65%。按常規程序進行免疫接種[1日齡小鵝瘟0.5 mL/只，8日齡鵝副黏二聯滅活病毒疫苗0.4 mL/只，15日齡禽流感(H5/H9)二價滅活油苗0.4 mL/只，30日齡鵝禽流感(H5/H9)二價滅活油苗0.5 mL/只]。每天記錄喂料量、溫度、死淘數等相關數據，注意觀察鵝的生長狀況。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 免疫性能指標

1.4.1.1 免疫器官指數的測定

于28、106日齡，每重復選取2只體重接近該組平均體重的鵝進行屠宰，切取胸腺、脾臟、法氏囊等免疫器官，去除脂肪后用濾紙吸干血水進行準確稱重。按下式計算胸腺、脾臟和法氏囊指數：

免疫器官指數/mg/g=免疫器官重/活體重

1.4.1.2 禽流感抗體效價的測定

在接種鵝群禽流感疫苗后7、14、21、28 d，從各重復隨機抽取2只試驗鵝，翅靜脈采血、分離血清，采用血凝和血凝抑制試驗法(HA-HI)測定鵝禽流感抗體滴度。

1.4.2 肝臟組織切片的制作和比較

于106日齡，每重復選取2只體重接近該組平均體重的鵝，頸靜脈放血處死，在肝臟最大葉距邊緣8 mm處切取小塊組織，生理鹽水清洗后迅速放入10%甲醛固定液中，固定48 h，按常規組織切片制作要求，將固定的標本經水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色等處理后，在室溫下切成約6 μm厚的切片，蘇木精-伊紅染色法染色制成組織切片，光學顯微鏡下觀察并拍片，進行肝臟組織學比較。

1.5 統計分析

采用SPSS17.0軟件中單因素方差分析(One-Way ANOVA)，LSD法多重比較。試驗數據以“平均數±標準差”表示。通過回歸分析對劑量-效應關系作二次曲線擬合，根據二次方程計算最適添加量。P<0.05和P<0.01分別為差異顯著和極顯著水平。

2 結果

2.1 膽堿對鵝免疫性能的影響

2.1.1 膽堿對鵝免疫器官指數的影響

所有處理組鵝的免疫器官外觀未見異常。由表2可知，4周齡時，胸腺、脾臟、法氏囊指數基本都呈現先升高后降低的趨勢。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組胸腺指數均高于Ⅰ組，其中Ⅴ組極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)，顯著高于Ⅵ組(P<0.05)，其他各組間均差異不顯著(P>0.05)；脾臟指數中，Ⅰ組數值均低于其他各處理組，其中Ⅳ組極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)，顯著高于Ⅱ、Ⅵ組(P<0.05)；法氏囊指數中，Ⅰ組均低于其他各處理組，其中Ⅲ組極顯著的高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組(P<0.01)，顯著高于Ⅳ、Ⅵ組(P<0.05)。通過回歸分析，胸腺、脾臟、法氏囊指數與膽堿添加水平間的二次曲線關系不顯著(R2<0.700)。

15周齡時，胸腺、脾臟指數也都呈現先升高后降低的趨勢。其中Ⅴ組胸腺指數極顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ組(P<0.01)，顯著高于Ⅲ組(P<0.05)；Ⅳ組脾臟指數顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ組(P<0.05)，極顯著高于Ⅵ組(P<0.01)；Ⅰ、Ⅲ法氏囊指數顯著高于其他各處理組(P<0.05)，且各處理組之間差異不顯著(P>0.05)。通過回歸分析，胸腺、脾臟指數與膽堿添加水平間的二次曲線關系不顯著(R2<0.700)。

表2 飼糧中不同水平膽堿對青農灰鵝免疫器官指數的影響/mg/g

注：同一飼養階段中同列數據肩標相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，相鄰和相隔小寫字母分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同。

2.1.2 膽堿對鵝禽流感抗體效價的影響

由表3可知，免疫后14、21、28日血清禽流感抗體效價呈先升高后降低趨勢，且Ⅲ處理組抗體效價較高，但免疫后4個時期各處理組間血清抗體效價差異均不顯著(P>0.05)。通過回歸分析，擬合二次曲線得出，不同水平處理組膽堿與免疫后7、14、21、28日血清禽流感抗體效價二次關系不明顯(R2<0.700)。

表3 飼糧中不同水平膽堿對青農灰鵝血清禽流感抗體效價的影響/log2

2.2 膽堿與鵝肝臟組織學觀察

Ⅰ、Ⅱ組鵝肝臟表面呈紅褐色，部分肝臟略有腫大，肝臟切面有油脂滲出。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組鵝肝臟均呈正常的紅褐色，表面光滑，切面均無油脂滲出。H.E染色后，觀察15周齡時青農灰鵝肝臟脂肪沉積情況(圖1)，結果發現，Ⅰ組鵝部分肝臟細胞脹大變型，細胞內出現大量脂肪空泡，有部分油滴融合成了油囊，有的脂肪滴連成一片，將細胞核擠壓到一側，但肝細胞完整，未發現肝細胞嚴重受損(圖1a)。Ⅱ組鵝肝細胞仍有大量脂肪空泡，但脂肪組織沉積量比Ⅰ組有所好轉(圖1b)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組鵝肝臟呈現規則的肝細胞形態，細胞核清晰可見，部分細胞中有少量空泡，不影響肝細胞的大小和形態(圖1c～圖1f)。

圖1 青農灰鵝肝臟組織學切片

3 討論

3.1 膽堿對鵝免疫性能的影響

免疫器官指數和血清抗體效價是反映機體免疫性能的重要參考指標。胸腺、脾臟、法氏囊是家禽的主要免疫器官，其中法氏囊和胸腺屬于中樞免疫器官，主要參與體液免疫，脾臟則與體內淋巴細胞參與細胞免疫，胸腺、脾臟和法氏囊的指數可用于評價雛雞的免疫狀況[12]。有研究表明，免疫器官指數降低是由于免疫抑制所致，而免疫器官指數增加則是免疫增強的表現[13]。禽流感抗體效價是反映機體禽流感免疫狀態的指標。抗體效價的高低直接反映了機體的體液免疫狀態，同時也表明動物體對疫病的抵抗力。Tsiagbe等[10]研究發現，向飼糧中添加不同水平膽堿，可促進肉仔雞生長，但對機體免疫反應無顯著影響。許麗[14]試驗表明，在5日齡和20日齡分別給試驗雞滴眼接種新城疫疫苗，在28日齡試驗結束時測得不同日糧處理間血清新城疫血凝抑制抗體效價(HI)差異不顯著。本試驗表明，隨著飼糧膽堿添加水平的增加，各處理組胸腺、脾臟、法氏囊指數差異顯著，且均呈現先升高后降低的趨勢，但飼糧中膽堿添加水平對血清禽流感抗體效價差異不顯著。綜合考慮不同膽堿添加水平對各免疫器官指數和血清禽流感抗體效價的影響，并結合生產成本等方面的問題后得出，飼糧中添加1 200 mg/kg 膽堿即可滿足鵝免疫性能的需要。飼糧中添加膽堿對鵝免疫器官的影響可能與膽堿是機體活性甲基的供體有關。有研究發現，膽堿的活性甲基可在脫氫酶的作用下釋放出來，參與合成如蛋氨酸、肉堿、肌酸、磷脂、腎上腺素、DNA和RNA等具有重要生理功能的物質[15-18]。飼糧中膽堿的添加，提高了動物體內的甲基含量，增加半胱氨酸轉化為蛋氨酸的循環次數，替代部分蛋氨酸，使更多的氨基酸用于體蛋白質的合成，提高了蛋白質的利用率[19]，促進免疫器官的發育，參與機體的合成代謝。同時膽堿作為甲基供體，間接參與肉堿合成，促進DNA復制，促進免疫器官細胞的增殖與分化，提高機體免疫功能。膽堿還是構成細胞膜和神經遞質乙酰膽堿的組成成分，還可通過提高生物膜和神經系統的功能來間接的影響免疫器官生長發育。但關于膽堿對血清抗體效價影響不顯著的原因尚不明確。鑒于國內外關于飼糧膽堿添加量對家禽免疫性能影響方面的研究報道較少，膽堿對鵝免疫水平的作用機理尚不明朗，有待于進一步深入探討。

3.2 膽堿對鵝肝臟組織學影響

膽堿對降低動物肝臟脂肪沉積起著重要作用。基于目前對膽堿和蛋氨酸代謝的生化研究，膽堿氧化、蛋氨酸再甲基化和脂肪酸氧化三者的有機結合，共同構成了膽堿降低動物脂肪沉積的營養代謝途徑[17]。王斯佳等[6]研究結果表明，膽堿和蛋氨酸對1～21日齡肉仔雞的脂肪代謝影響顯著，飼糧中添加適當膽堿可有效減少腹脂沉積以及肝臟中脂肪的積累。高立云等[20]研究結果顯示，飼糧中添加膽堿可有效減少臟臟細胞內的脂肪空泡數量，肝細胞膜界限較清晰。本試驗鵝肝臟組織學切片表明，飼糧中添加膽堿可有效減少青農灰鵝肝臟組織中脂肪沉積，防止肝臟脂肪的異常積累。這一結果與上述研究結果相一致，其原因可能是膽堿是甲基供體，通過合成卵磷脂，將脂肪以脂蛋白的形式運出肝臟，同時膽堿通過促進肉堿合成，提高機體細胞內脂肪酸氧化水平，促進機體內脂肪酸分解代謝而降低動物脂肪沉積[15,21]。當飼糧膽堿缺乏時，低密度脂蛋白形成相應減少，限制了底物的有效利用，并最終阻滯三酰甘油從肝細胞分泌，導致脂肪代謝異常，脂類在小腸中的吸收和轉運受阻[22]。

4 結論

4.1 本試驗條件下，飼糧添加膽堿能顯著提高青農灰鵝免疫器官指數。從提高鵝的免疫性能和生產成本等方面考慮，飼糧膽堿適宜添加水平選擇1 200 mg/kg。

4.2 飼糧添加膽堿能有效減少青農灰鵝肝臟脂肪沉積，當膽堿添加水平為1 200～3 000 mg/kg時，均可有效改善鵝肝臟脂肪沉積現象。

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Effects of Choline Added into Feed on Immune Function and Liver Histology of Geese

Zhang Wenxu1Wang Baowei2Mao Ke3Ge Wenhua2Zhang Mingai2Li Wenli1
(College of Animal Science and Technology,Qingdao Agricultural University1,Qingdao 266109)(Institute of High Quality Waterfowl, Qingdao Agricultural University2, Qingdao 266109)(Qingdao Vland Biotech Group Co.,Ltd.3, Qingdao 266061)

This experiment was conducted to study the effects of different choline level added into feed on immune function and liver histology of geese. One hundred and eighty one-day-old "Qingnonghui" geese were selected and randomly divided into 6 groups with 3 replicates in each group and 10 geese in each replicate. Geese in the six groups were fed the corn-soybean basal diets supplemented with 0, 600, 1 200, 1 800, 2 400 and 3 000 mg/kg choline, respectively. The experiment lasted for 15 weeks. The results showed as follows: 1) The supplementation of choline significantly increased immune organ index of geese aged 1 to 4 weeks and 1 to 15 weeks (P<0.05 orP<0.01), but there was no significant difference in antibody titre of Bird Flu disease(P<0.05). 2) in no choline group, swelling of hepatocyte was observed and the cytoplasm was full of fat cavitation, and the cell nuclei are squeezed to one side. The supplementation of 1 200～3 000 mg/kg choline in diets can decrease fat deposition of hepatocyte effectively. In conclusion, the supplementation of choline in diets for "Qingnonghui" geese is feasible, and the optimum supplemental level is 1 200 mg/kg.

choline, geese, immune function, liver histology

S835

A

1003-0174(2014)06-0069-05

國家水禽技術產業體系(CARS-43-11)，青島市科技計劃項目(11-2-3-23-nsh)

2013-06-28

張文旭，女，1987年出生，碩士，動物營養與飼料科學

李文立，男，1965年出生，教授，動物營養與飼料科學