間接競爭ELISA法檢測谷物中T-2毒素

唐世云 武玉香 曲光剛 付石軍 沈志強

(山東省濱州畜牧獸醫研究院1，濱州 256600)(山東綠都生物科技有限公司2，濱州 256600)

間接競爭ELISA法檢測谷物中T-2毒素

唐世云1武玉香2曲光剛1付石軍1沈志強1

(山東省濱州畜牧獸醫研究院1，濱州 256600)(山東綠都生物科技有限公司2，濱州 256600)

T-2 毒素是單端孢霉烯族毒素的重要代表，在單端孢霉烯族毒素中毒性最強，是主要的食品污染源之一，用間接競爭酶聯免疫分析法(ELISA)對谷物中的T-2毒素進行了測定。從樣品的處理、T-2毒素的添加回收及ELISA的實驗檢測等方面進行試驗，最終結果用分析軟件分析相關數據得到相關系數為0.998，IC50為1.3 μg/kg，標準品濃度為0～16.2 μg/kg，靈敏度為0.2 μg/kg，添加回收率均大于90%。該法測定T-2毒素方法簡便，特異性高，靈敏度高，重復性好，適合用于檢測谷物中的T-2毒素。

間接競爭酶聯免疫分析 T-2毒素 谷物

T-2毒素主要是三線鐮刀菌產生的單端孢霉烯族化合物(trichothecenes，TS)之一。它廣泛分布于自然界，是常見的污染田間作物和庫存谷物的主要毒素，對人、畜危害較大[1]。

1973年聯合國糧農組織(FAQ)和世界衛生組織(WHO)在日內瓦召開的聯席會議上，把這類毒素同黃曲霉毒素一樣作為自然存在的最危險的食品污染源。人畜誤食污染有T-2 毒素的谷物后，可引起急性中毒，危及人們的生命安全和身體健康[2-3]。該病是一種非常嚴重的常引起死亡的人類真菌毒素中毒癥[4-5]。T-2毒素由Bamburg于1968年首次分離提純并確認了化學結構。T-2毒素為白色針狀結晶，鐮刀菌在谷物上適宜繁殖溫度為16～24 ℃，相對濕度為85%；如在土壤中則分別為12～24 ℃和40%～60%。凡適合此菌生長繁殖的地區的玉米、麥類、稻谷、豆類、薯類等作物上均易感染此菌[6]。近年有研究提出，T-2毒素對食用糧(小麥、玉米)的污染導致了另一種地方病——大骨節病(KBD)的發生[7]。

T-2毒素對不同動物的毒性有一定種屬差異，新生或未成年動物比成年動物對毒素更敏感。亞急性和慢性毒性作用可導致骨髓和淋巴組織壞死、溶解，外周血干細胞減少和淋巴細胞嚴重缺乏[8]。為此我國對飼料中的T-2毒素的允許量做出了規定，如表1所示。

表1 GB 21693—2008 配合飼料中T-2毒素的允許量

現在T-2毒素主要的檢測方法為液相色譜法(LC)、氣相色譜法(GC)及免疫法等。酶聯免疫吸附分析法(ELISA)具有樣品前處理簡單、快速方便、特異性和靈敏度高且不需要昂貴的儀器設備等特點，比較適合推廣普及可以進行定性和定量測定，大大節約了測試成本，因而ELISA法可以廣泛用于T-2毒素的測定[9]。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

T-2毒素與載體蛋白-牛血清白蛋白的結合物(T-2-BSA)、T-2毒素單克隆抗體：山東綠都生物科技有限公司；辣根過氧化酶(HRP)：北京賽弛生物科技有限公司；T-2毒素標準品：北京華安麥科生物技術有限公司；四甲基聯苯胺(TMB)：上海紫一試劑廠；牛血清白蛋白(BSA)：廣州蕊特生物科技有限公司； 96孔酶標板：上海研謹生物科技有限公司；其他化學藥品均為分析純；谷物(小麥、玉米、小米、大米)：本地農貿市場。

1.2 儀器與設備

TDL-40B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；MK3型酶標儀：美國Thermo公司； JE1002型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；QL-866振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DRP-9272型電熱恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；Genex Beta單道和多道微量移液器：荷蘭百得公司；離心管：海門博陽實驗器材廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗原理

采用間接競爭ELISA法檢測樣本中T-2毒素含量。酶標板微孔內預先包被有T-2毒素的抗原，加入標準液或樣本、酶標記物、T-2毒素抗體后，樣本或標準液中的T-2毒素抗原和微孔內包被的偶聯抗原競爭結T-2毒素抗體，用底物液顯色，樣本和標準液中的T-2毒素含量與吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出T-2毒素含量。

1.3.2 酶標板的包被

將T-2毒素的抗原用包被緩沖液(pH 9.6 0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液)稀釋，包被到酶標板微孔中，每孔100 μL，4 ℃過夜。

酶標板用洗滌液洗滌3次，加封閉液封閉2 h后烘干保存備用。

1.3.3 ELISA溶液的制備

樣品提取液80%甲醇，包被緩沖液為pH 9.6的碳酸鹽緩沖液；洗液為含0.05%吐溫-20的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；底物緩沖液為pH 5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液；底物A：稱取TMB 17.2 mg，加DMSO 1 mL溶解，然后加醋酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 5.5)66 mL；底物B：取雙蒸水100 mL，加30% H2O217 μL；終止液：2 mol/L硫酸。

1.3.4 標準品配制

用10%甲醇將T-2毒素標準品依次配成0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2 μg/kg 6個濃度，作為標準品的濃度。

1.3.5 樣品處理

稱取粉碎谷物樣品(小麥、玉米、小米、大米)(2.0±0.05)g至離心管中，加入30 mL樣品提取液， 震蕩提取1 min；4 000 r/min離心5 min；小心移取上清液100 μL 加到900 μL 1×T-2毒素谷物稀釋液中混勻，取50 μL用于分析。稀釋倍數為150倍。

1.3.6 樣品測定

將所需試劑從冷藏環境中取出，待其完全回升至室溫(20～25 ℃)后方可使用。注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

加標準品/樣品、酶、抗體：加標準品/樣品50 μL到對應的微孔中，加入T-2毒素酶標物50 μL/孔， 再加入T-2毒素抗體50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37 ℃避光環境中反應20 min。

洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250 μL/孔，每次靜置20 s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。

顯色：加入底物液A液50 μL/孔，再加底物液B液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37 ℃避光環境中反應10 min。

測定：加入終止液50 μL/孔，用酶標儀立即測定450 nm處的吸光度值(建議用雙波長450/630 nm)檢測。

1.3.7 數據處理

Ridasoft .win軟件作為ELISA方法結果分析軟件，操作簡單易行，只需將數據輸入軟件，就可以自動進行數據分析，解決了數據處理煩瑣的問題。現將原始吸光度值及標準品的濃度按軟件的要求輸入到電腦中，點擊軟件中的不同圖標可以得到不同的曲線，ELISA分析中常用的是擬合曲線及標準曲線。試驗數據用軟件處理后，不但可以看到試驗數據是否理想，還可以直接得出試驗樣品中的T-2毒素含量，非常方便，省去了煩瑣的計算。

2 結果與討論

2.1 函數曲線的繪制

以標準品百分吸光率為縱坐標，以T-2毒素標準品濃度(μg/kg)為橫坐標，繪制函數曲線圖,如圖1。將樣本的百分吸光率代入曲線中，從曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中T-2毒素實際濃度。以logit/log 作圖，logit為縱坐標，T-2毒素標準品濃度為橫坐標， logit= ln (p/q)，p=B/B0，q=1-p， 標準曲線如圖2，其中B為不同濃度標準品的吸光值，B0為標準品濃度為0時的吸光值。

圖1 擬合曲線

圖2 標準曲線

由擬合曲線和標準曲線可以看出，在0～16.2 μg/kg含量范圍內，T-2毒素標準品曲線有良好的線性關系，線性方程為：y=-1.9x+1.8，相關系數為0.998，IC50為1.3 μg/kg(擬合曲線得到的IC50是根據實際數據得到的，標準曲線的IC50值經過修正，故確定1.3 μg/kg為最終的IC50)。經計算得知，當T-2毒素質量濃度達到0.2 μg/kg時，抑制率為19.3%，可以確定T-2毒素間接競爭ELISA法檢測的靈敏度為0.2 μg/kg 。

2.2 谷物中T-2毒素含量的測定結果

每個樣品取2個平行樣品，按同一方法處理、測定，測定結果見表2。

表2 谷物中T-2毒素含量的測定結果

酶標儀讀出吸光值后輸入Ridasoft .win軟件， 從軟件的分析結果中直接可以得到最終樣品中的T-2毒素的含量。從結果中可以看到，T-2毒素在谷物中的含量遠遠低于目前在飼料中的限量標準(≤1 mg/kg)，也低于以色列等國規定的谷物飼料中的限量值(≤100 μg/kg)，可以認為市場采購的這些谷物是安全的。

2.3 添加回收試驗

選玉米樣品，分別加入質量濃度為30、80 μg/kg的T-2毒素標準品；選小麥樣品，分別加入濃度為4、6 μg/kg的T-2毒素標準品。按1.3.5樣品處理方法并測定，樣品做2個平行，同時測定樣品空白對照，計算回收率。結果如表3所示，玉米樣品的添加回收率分別為92.3%和93.6%，小麥樣品的添加回收率在95.0%和93.3%，符合方法的要求(要求回收率70%～120%)說明該方法回收效率較高，重現性好。

表3 T-2毒素回收率試驗結果

3 結論

用該ELISA快速檢測方法檢測谷物中T-2毒素的含量，樣品前處理簡單，適用范圍廣；標準品含量在0～16.2 μg/kg含量范圍內線性關系良好，線性關系達到0.998，具有較高的靈敏度；添加回收率均在90%以上，重復性好，滿足分析的要求。間接競爭ELISA檢測法耗時短(總耗時約1 h)，為準確測定谷物、飼料及其原料中T-2毒素的含量提供了簡便有效方法。

[1]王敏輝,李呂木,丁小玲.T-2毒素研究進展[J].動物營養學報，2011，23(1)：20-24

[2]Bamburg J R，Strong F M.12,13-E-poxytrichothecenes[M]//Kadis S,et al.Algal and fungal toxins.New York:Academic Press.Inc.，1971，7：207-292

[3]Ueno Y.Trichothecenes:overview address[M]/Rodricks J V,Hesseltine C W,Mehlman M A.Mycotoxins in human and animal health，Pathotox Publishers,Inc.,Park Forest South,Ill，1977：189-207

[4]Croft W A.Ariboren outbreak of trichothecene toxicosis[J].Atmospheric Environment，1986，20(3)：549-552

[5]Kupchan S M,Streelman D R,Jarvis B B,et al.Isolation of potent new antileukemic trichothecenes fromBaccharismegapotamica[J].Journal of Organic Chemistry，1977，42(26)：4221-4225

[6]楊建伯,孫殿軍,王志武.大骨節病病區病戶主食中T-2毒素檢出報告[J].中國地方病學雜志，1995，14(3)：146-149

[7]陽傳和,羅雪云,計融,等.小麥中T-2 毒素的污染調查[J].微生物學報，1992，32(6)：450-455

[8]馮杏婉,趙修南,李鳳仙,等.T2毒素對小鼠外周血象和骨髓造血干、祖細胞的作用[J].中國藥理學與毒理學雜志，1989，3(2)：144-148

[9]林妮妮,趙燕華,郭磊,等.T-2毒素的分析檢測方法及代謝研究進展[J].軍事醫學,2012 ,36(6):471-475.

Indirect Competitive ELISA Method for Detecting T-2 Toxin in Cereals

Tang Shiyun1Wu Yuxiang2Qu Guanggang1Fu Shijun1Shen Zhiqiang1
(Shandong binzhou animal science and veterinary medicine academy1, Binzhou 256600)(Shandong Lvdu Biotechnology Co., Ltd.2Binzhou 256600)

T-2 toxin is one of the important representatives of trichothecenes and also the most toxic element amoung trichothecenes. It has been one of the major pollution sources of food. T-2 toxin in cereal has been determined by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The study included sample treatment, the addition and recycling of T-2 toxin, the detection of ELISA assay and so on. The data of analysis software showed that the linear correlation coefficient was 0.998, IC50of 1.3 μg/kg, standard concentration of 0～16.2 μg/kg, sensitivity of 0.2 μg/kg and recover rate of above 90%. The determination method of T-2 toxin has advantages; it si simplewith high specificity, high sensitivity, good repeatability and is suitable for detecting T-2 toxin in cereals.

indirect competitive ELISA, T-2 toxin, cereals

S51

A

1003-0174(2014)06-0118-04

2013-06-23

唐世云，男，1974年出生，助理研究員，食品加工與安全

沈志強，男，1963年出生，研究員，預防獸醫學研究與開發