人Cu，Zn-SOD在重組畢赤酵母中表達的發酵工藝研究

鄭屹峰，孫金鈺，巫啟明，郭建輝，林春通，劉樹滔，饒平凡

(福州大學生物工程研究所，福建福州 350116)

超氧化物歧化酶(superoxide dismutaes，EC 1.15.1.1)是生物體內的一種十分重要的金屬酶，依照結合的金屬離子，可分為Cu，Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD四種［1］.但哺乳動物體內僅有Cu，Zn-SOD和Mn-SOD.就穩定性來說，Cu，Zn-SOD高于Mn-SOD，且前者在人體內分布更為廣泛.盡管不同來源的Cu，Zn-SOD具有明顯的進化保守性，但其間仍有微弱的免疫原性，如人和牛Cu，Zn-SOD之間序列同源性高達80%以上［2］，但牛血Cu，Zn-SOD在臨床應用時，仍有產生免疫性過敏反應的可能［3］.早期曾由人血中提取Cu，Zn-SOD［4］，但操作較為繁瑣，因此開展了表達人Cu，Zn-SOD工程菌的研究.施惠娟［5］等人通過原核體系表達人Cu，Zn-SOD基因，采用5 L罐發酵，產物酶活力可達950 U/mL培養基，但所得產物中雜蛋白較多.他們還通過畢赤酵母表達人Cu，Zn-SOD基因［6］，但表達量極低.本研究通過搖瓶及5 L發酵罐實驗探討不同因素對重組畢赤酵母表達人Cu，Zn-SOD的影響，以期提高重組人Cu，Zn-SOD的表達水平，為實現人Cu，Zn-SOD的工業化生產奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 菌種

GS115/αA-SOD畢赤酵母菌株由福州大學生物工程研究所提供.

1.2 藥品

Yeast Extract和Tryptone購自OXOID公司;黃嘌呤購自Sigma公司;黃嘌呤氧化酶購自Roche Diagnlstics公司;甘油、鹽酸羥胺、冰醋酸等均為分析純.

1.3 儀器設備

紫外分光光度計(日立U-1900);Avanti TM J-251高速離心機(Beckman Coulter公司);5L發酵罐(中國麗Biof-6005型);恒溫培養振蕩器(上海智城ZHWY-200B)等.

1.4 培養基

種子液培養基YPG:1%Yeast Extract，2%Tryptone，

2%甘油;搖瓶實驗培養基:YPG(同上)及FM22培養基［7］.FM22培養基配方(g/L):KH2PO442.9，(NH4)2SO45，CaSO4·2H2O 1.0，K2SO414.3，MgSO4·7H2O 11.7，甘油 40.PTM4 微量元素溶液配方 (g/L):CuSO4·5H2O 2.0，NaI 0.08，MnSO4·H2O 3.0，Na2MoO4·2H2O 0.2，H3BO30.02，CaSO4·2H2O 0.5，CoCl20.5，ZnCl27，FeSO4·7H2O 22，生物素0.2，濃硫酸1 mL.

搖瓶及5 L罐發酵基礎料培養基為FM22培養基+2 mL/L PTM4，5 L罐發酵補料培養基為50%甘油(質量分數)+30%甲醇(體積分數)，上述FM22培養基均添加0.15%(體積質量)組氨酸.

1.5 培養方法

搖瓶培養:從斜面挑取菌落接入種子培養基中，(100 mL三角瓶裝液量20 mL)，培養至一定濃度轉接至500 mL三角瓶中培養(裝液量100 mL)，培養24 h后用誘導劑甲醇進行誘導，之后每隔24 h補加甲醇.搖床溫度30℃，轉速200 r/min.每批試驗的每一梯度均做兩個平行，所有試驗均進行一次相同重復試驗，由于不同批次試驗存在一定誤差，故未將重復試驗與原始數值一同進行統計分析，僅驗證趨勢是否與之前試驗相符.

5 L罐培養:參考畢赤酵母發酵手冊［8］

1.6 驗證方法

為驗證目的蛋白是否表達，通過SOD蛋白免疫印記，驗證蛋白免疫原性.測定SDS-PAGE時上相同的兩個樣品和WB Marker，一個樣品進行考馬斯亮蘭染色，另一樣品進行蛋白免疫印跡.一抗用的是兔抗人SOD1，二抗用的是羊抗兔IgG，Marker也可結合二抗，因此可以伴隨SOD一起顯色.

1.7 分析方法

菌體濃度測定:比色法，以600 nm波長光吸收值OD600表示;發酵液上清制備(4℃，12 000 r/min，10 min);SOD酶活測定及目的蛋白分子量確定:鹽酸羥胺法和SDS-PAGE［9］，采用SPSS統計分析軟件進行數據處理.

2 結果與討論

2.1 蛋白免疫印跡

考染條帶與WB條帶對照結果表明(圖1)，凝膠上考染顯示電泳純的目的條帶可以與SOD1抗體發生特異性結合，在PVDF膜上顯示清晰條帶.

圖1 SOD蛋白電泳考馬斯亮蘭染色與蛋白免疫印跡Fig.1 Coomassie blue stain and western blot of SOD

2.2 發酵初始p H值對目的蛋白表達水平的影響

用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液將發酵培養基(YPG)pH值調至4.0、5.0、6.0和7.0，在30℃搖床培養24 h后用1%甲醇誘導120 h，測定樣品酶活(圖2)并進行SDS-PAGE電泳.酶活數據經SPSS軟件分析得F值為108.582，查表F0.01(3，4)=16.69.組間差異極顯著，說明不同pH值對菌株目的蛋白表達水平影響極大.由于初始pH值為7時酶活最高，故取pH=7為最優初始pH值.此外，電泳目的條帶也隨pH值升高而增粗(圖3，由于采用銀染故背景色較灰暗，下同).但初始pH值達到7后，繼續提高pH值對目的蛋白表達水平影響不大(由于差異不大，此處未列出).在pH值3～8范圍內，畢赤酵母均可正常生長，而誘導表達時不同pH值極大影響目的蛋白表達.可能目的蛋白在pH值6～10之間熱穩定性較好［10-11］;此外，較低pH值提高了畢赤酵母細胞死亡率，細胞一旦死亡，胞內蛋白酶釋放進入上清液，使目的蛋白降解［12］.

圖2 不同初始pH值的酶活情況Fig.2 Enzyme of activity of different initial pH

圖3 不同pH值梯度的電泳銀染圖Fig.3 Silver staining of samples with different pH

2.3 誘導劑濃度對目的蛋白表達水平的影響

在30℃搖床培養24 h后用不同濃度梯度誘導劑誘導120 h，測定樣品酶活(圖4).誘導劑濃度分4個梯度，分別為1%、2%、3%和4%培養基體積.經SPSS軟件分析，F值為66.55，查表得F0.01(3，4)=16.69.說明組間差異極顯著，并且當誘導劑濃度為1%時酶活最高，故取1%培養基體積為最優誘導劑濃度.甲醇利用型畢赤酵母以誘導劑甲醇為其唯一碳源時，若甲醇濃度過低將限制菌體生長從而影響目的蛋白的表達，故本實驗未選取低于1%的甲醇濃度進行實驗.試驗中最佳誘導劑濃度是1%(體積分數)，超過這一濃度后目的蛋白表達量開始下降，可能因為畢赤酵母在以甲醇為唯一碳源時，其代謝產物甲醛和過氧化氫的積累對畢赤酵母有毒害作用［13］.

圖4 不同誘導劑濃度的酶活情況Fig.4 Enzyme activity of different concentration of inducer

2.4 培養基組成對目的蛋白表達水平的影響

通過上述實驗得知，目的蛋白表達水平在pH值4.0～7.0之間隨pH值升高而升高，但考慮到采用無機鹽培養基FM22進行培養發酵時，由于鹽濃度較高，pH值較高時易產生沉淀，故初始pH定為6.0.為了便于比較，YPG培養基也用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液調至pH=6.0.目的蛋白表達水平方面，經SPSS軟件分析，F值為2 346.312明顯高于F0.01(2，3)=30.82，說明不同培養基之間差異極顯著.FM22培養基(有His)中菌株表達水平遠高于其它兩種培養基，故取FM22培養基(有His)為最優培養基(圖5、6).該菌株在不同培養基中目的蛋白表達水平差異巨大，但YPG培養基中蛋白總量顯著高于FM22培養基(圖6中YPG電泳條帶明顯較FM22培養基雜)，可能因為:①YPG自身蛋白較多;②YPG培養基中酵母膏(Y)、蛋白胨(P)成分復雜，使得菌株的甲醇利用率大大降低，菌株利用培養基中過剩的營養物質大量合成各種非目的蛋白.因此該菌株的培養關鍵是:在維持菌株正常生長的條件下，盡可能減少培養基中可能作為碳源的物質，使甲醇成為唯一碳源，目的蛋白才可能高效表達.

圖5 不同培養基的酶活情況Fig.5 The enzyme activity of different mediums

圖6 不同培養基的電泳銀染圖Fig.6 Silver staining of samples with different mediums

2.5 組氨酸添加量對目的蛋白表達水平的影響

在上述優化條件的基礎上，改變培養基中組氨酸濃度，設定六個濃度梯度分別為:0.05%、0.15%、0.5%、1%、2%和3%(體積質量)，酶活數據如圖7.經SPSS軟件分析得F值為204.592，F0.01(5，6)=8.75可知不同組氨酸濃度對菌株目的蛋白表達水平有極顯著影響.雖然在2%與3%組氨酸濃度下，菌株目的蛋白表達水平高于其它水平，但經濟性差.當d f=6時，LSD0.01=28.58，LSD0.05=18.86，0.15%的組氨酸濃度下蛋白表達水平顯著高于0.05%，與0.5%，1%無顯著差異，故選擇0.15%組氨酸濃度作為最優組氨酸濃度.就整體趨勢來看目的蛋白表達水平隨組氨酸濃度的增加而增加.可能因為:雖然組氨酸缺陷型畢赤酵母僅需要少量組氨酸維持生長及表達目的蛋白，但無機鹽培養基發酵后期氮源供應不足，多余的組氨酸可作為氮源供菌株利用.

圖7 不同組氨酸濃度的酶活情況Fig.7 Enzyme activity of different Histidine concentration

2.6 誘導溫度對目的蛋白表達水平的影響

在上述優化條件的基礎上，進行誘導溫度的確定.菌株均在30℃下培養24 h，僅誘導時改變溫度至27、30和33℃，誘導120 h后測定酶活(圖8).經SPSS軟件分析，F=137.5，F0.01(2，3)=30.82，說明溫度對目的蛋白表達水平有極顯著影響.并且誘導溫度為27℃時菌株目的蛋白表達水平最高(圖8、9)，故取27℃作為菌株最佳誘導溫度.可能原因:雖然畢赤酵母在28～30℃時菌體生長情況最佳，但較低的誘導溫度有助于降低細胞死亡率及畢赤酵母自身蛋白酶活性［13］，從而提高目的蛋白得率.

圖8 不同誘導溫度的酶活情況Fig.8 The enzyme activity of different inducing temperature

圖9 最終搖瓶電泳考染圖Fig.9 Coomassie blue staining of final samples in shake flask

2.7 最終優化條件確定

誘導溫度27℃，FM22培養基(0.15%(體積質量)組氨酸+2 mL/L PTM4)，初始pH=6.0，誘導劑濃度1%(體積分數)，培養24 h后誘導，誘導120 h后收樣，最終酶活895 U/mL，總蛋白為0.23 mg/mL，比活為3 891 U/mg.較最初采用YPG培養基(不調節初始pH值)、誘導溫度30℃、誘導劑濃度2%時的94 U/mL酶活提高約8.5倍.較遲春萍［14］等人正交優化后搖瓶試驗結果625 U/mL(酶活測定用試劑盒為南京建成出產，測定方法為羥胺法)提高40%，遠高于施惠娟［6］等人的77 U/mg比活.Yu［15］的研究中，比活為83 U/mg，遠低于本實驗，并且其雜蛋白極多.

最終結果如圖7，優化后雜蛋白極少，目的條帶明顯.誘導96 h后，目的蛋白表達水平提高不明顯，為避免發酵后期資源浪費及染菌風險，因此該菌株搖瓶培養最佳誘導時間為96 h.

2.8 5 L罐發酵

在搖瓶實驗的基礎上嘗試了5 L罐發酵，以期獲得更高水平的目的蛋白表達量.該菌株在培養24 h即誘導前測得酶活527 U/mL，開始誘導后酶活急劇攀升，至誘導120 h后獲得最高酶活13 539 U/mL(圖10)，隨后保持平衡，至發酵最后2日(培養196 h，216 h時)菌體濕重下降，溶氧陡增，標志著菌株進入衰退期.此時酶活有所下降，可能由于此時部分菌體裂解，菌體內部蛋白水解酶釋放，水解部分目的蛋白.因此該菌株發酵周期不宜過長，誘導120 h(培養144 h時)左右即可放罐.之前嘗試采用單一甲醇誘導，表達水平極低(圖11(a))，后采用甲醇甘油混合飼喂進行培養，表達水平大大提高(圖11(b))，可見誘導方式對菌株目的蛋白表達水平影響極大.可能因為:甘油可為菌株基礎生命活動提供一定碳源及能源，使得菌株可以在維持生命活動的基礎上盡可能利用甲醇，此外由于采用甘油作為部分碳源，故甲醇用量減少從而降低發酵罐中甲醇及甲醇代謝產物殘留量，菌體活力提高，最終產物得率也隨之提高.本次試驗甘油甲醇混合飼喂將具體步驟為，菌重達145 g/L(培養24 h時)時進行甲醇誘導，誘導過程中逐步加大甲醇供應、減少甘油供應，但整個誘導過程必須始終維持少量甘油供應(以菌體濕重不下降為標準).

圖10 5 L罐發酵情況Fig.10 The result of fermentation in 5 L tank

圖11 5 L罐樣品電泳Fig.11 Coomassie blue staining of final samples in 5 L tank

3 結語

采用本文所述優化后的發酵工藝，目的菌株所表達的外源蛋白純度較高(圖11)，并且表達效率有較大提高.有效解決了利用大腸桿菌表達外源蛋白時多雜蛋白的問題，并在一定程度上提高了畢赤酵母表達外源蛋白的利用效率.提高畢赤酵母表達效率關鍵在于提高畢赤酵母甲醇利用率，但由于甲醇具有一定毒性，因此誘導方式又成為畢赤酵母工藝優化中的一個重要環節.本研究中對過去單一甲醇的誘導方式進行改進，采用甘油甲醇混合飼喂的誘導方式，使目的蛋白表達量大幅提高，此實驗僅為初步探索，后續將以此為基礎，進一步改進補料分批發酵的補料方式，使產率進一步提高，為實現該菌株的產業化生產提供更優化的數據.