14-3-3σ 蛋白在胃癌中的表達及其與臨床病理特征的關系

曾 超，李應廣，古超云，林翠霞（廣東醫學院基礎醫學院病理學教研室，廣東東莞523808）

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內發病率僅次于肺癌，位居第2 位[1]。我國是胃癌的高發區，不久前召開的第8 屆全國胃癌學術大會公布的數據顯示，我國每年新發胃癌40萬例，發病約占全世界的42%，但目前關于胃癌發病的具體分子機制仍不清楚。14-3-3 蛋白是哺乳動物細胞中含量較豐富的蛋白之一。真核細胞中14-3-3 蛋白通過與相關蛋白質相互作用，啟動細胞周期并監測DNA 損傷狀態，并可激活促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK），從而抑制細胞凋亡，與整聯蛋白（integrin）協調作用，調控細胞生長[2]。近年來，越來越多的研究證實，14-3-3 蛋白家族在腫瘤的形成和發展過程中起著非常重要的作用。14-3-3 蛋白在組織細胞中含量豐富，由7 個亞型組成（ε、β、γ、σ、λ、ζ、η），具有高度保守的蛋白序列結構，參與多種重要的細胞生理過程，包括信號轉換、免疫應答、凋亡和轉錄調控、調節黏附和細胞運動等[2]。最新研究表明，14-3-3σ 蛋白被認為是這7 個蛋白亞型中與癌癥的發生、發展關系最密切的蛋白。目前為止，14-3-3σ 蛋白與胃癌的關系國內外均很少報道。本實驗應用組織芯片技術結合免疫組織化學（免疫組化）方法檢測14-3-3σ蛋白在胃癌組織中的表達情況，并進一步統計分析14-3-3σ 蛋白表達與胃癌各臨床參數的關系，以期為胃癌的基因治療尋找有效的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇75 例胃癌手術患者癌組織及相應癌旁正常胃黏膜組織，患者年齡30～84 歲，中位年齡65 歲；男50 例，女25 例。胃癌臨床分期Ⅰ期9 例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期37 例，Ⅳ期1 例；腫瘤分化程度，高分化33 例，低、中分化42 例；腫瘤累及淋巴結48 例，未侵犯淋巴結27 例。。

1.2 材料與試劑 組織芯片（OD-CT-DgStm01-014）購自上海芯超生物科技有限公司，鼠抗人14-3-3σ 蛋白多克隆抗體（MS-1185）購于美國Santa Cruz 公司；即用型免疫組化超敏鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶連結法（SP）試劑盒（KIT-9701）、濃縮型3，3-二氨基聯苯胺（DAB）試劑盒均購于福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化SP 法 組織芯片采用微波抗原修復，單克隆14-3-3σ 蛋白一抗稀釋度1∶100，二抗為生物素標記，DAB 顯色，蘇木素對比染色，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。觀察結果以胞漿呈棕色顆粒為陽性。實驗步驟按照SP 法實驗試劑盒進行操作。

1.2.2 免疫組化結果評判 14-3-3σ 蛋白陽性表達主要定位于胃癌細胞胞漿。陽性表達評定以腫瘤細胞染色強度和腫瘤細胞陽性細胞比例的乘積決定。腫瘤細胞染色強度評分按未見著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別判定為0、1、2、3 分；陽性腫瘤細胞比例評分如下：陽性細胞數小于5%、5%～＜25%、25%～＜50%、50%～＜75%、≥75%，分別給予0、1、2、3、4 分。腫瘤細胞強度和陽性細胞數評分的乘積：＜2 分評定為陰性（-），≥2 分評定為陽性（+）。

1.3 統計學處理 應用SPSS16.0 統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 14-3-3σ 蛋白在胃癌組織與癌旁組織中的表達 組織芯片研究結果表明，14-3-3σ 蛋白在胃癌組織中表達主要定位于胞漿，其陽性表達腫瘤細胞呈彌散性散在分布，見圖1。統計學研究結果表明，14-3-3σ 蛋白在胃癌組織中的陽性表達率為88.0%，而在相應癌旁組織的陽性表達率為34.7%，兩組間14-3-3σ 蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（P=0.001），見表1。

圖1 組織芯片檢測胃癌組織中14-3-3σ 蛋白的表達

表1 胃癌組織與癌旁組織中14-3-3σ 蛋白的表達

2.2 胃癌組織中14-3-3σ 蛋白的表達與臨床病理特征的關系

統計學分析結果顯示，14-3-3σ 蛋白在胃癌組織中的表達與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉移、臨床分期均無顯著相關性，而與腫瘤大小有密切相關性，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 胃癌組織中14-3-3σ 蛋白的表達與臨床病理參數的關系[n（%）]

3 討 論

研究發現，14-3-3 蛋白家族主要通過調節腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移、細胞凋亡及相關信號通路等參與腫瘤的發生和發展[3-6]。Fanger 等[7]發現14-3-3ζ 蛋白可結合在促分裂原細胞外激酶-Ⅰ（MEKKⅠ）的調控結構域，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的作用，從而抑制細胞凋亡。14-3-3β 蛋白包含1 個可與整聯蛋白β1（integrin β1）相互作用的結合位點，它們之間的相互作用促進細胞擴散和遷移[8]。14-3-3γ 蛋白在人類肺癌細胞系H322中過表達可導致異常的DNA 復制和多倍體化，14-3-3γ 蛋白的過表達可使細胞繞過有絲分裂監測點，而促使腫瘤細胞異常增殖[9]。

目前研究表明，14-3-3σ 蛋白是14-3-3 蛋白家族中與腫瘤關系最為密切的蛋白。14-3-3σ 蛋白主要受抑癌基因p53 的調控，而p53 基因的損傷，可以直接影響14-3-3σ 蛋白的表達水平[10]。Pei等[11]研究表明，14-3-3σ 蛋白在大腸癌中表達上調。與此類似的是，Agarwal 等[12]使用免疫染色發現14-3-3σ 蛋白僅在胰腺癌組織中有表達，而在正常胰腺組織和慢性胰腺炎組織中無表達。值得注意的是，Yang 等[13]研究發現，14-3-3σ 蛋白在乳腺癌中處于低表達狀態。以上研究結果提示，14-3-3σ 蛋白在不同類型腫瘤中的表達情況可能并不一致，14-3-3σ 蛋白在各種腫瘤的發生、發展中所起的作用也可能不同。

本研究結果顯示，14-3-3σ 蛋白在胃癌組織與癌旁組織中的陽性表達率分別為88.0%和34.7%，提示14-3-3σ 蛋白可能參與了胃癌的發生和發展。王鳳超等[14]曾經報道，14-3-3σ mRNA 在胃癌中的表達水平較低，這與本研究結果有差異。推測可能是以下2 種原因導致了這種差異。首先，可能是所選取胃癌樣本的差異及樣本總體數量的差異；其次，王鳳超等[14]是在RNA 水平對14-3-3σ 基因表達進行研究。眾所周知，蛋白質才是決定細胞生物學功能的最終產物。而基因的表達到最終蛋白質的形成需要經過一系列復雜過程，例如復制、轉錄和翻譯。而RNA 的表達情況僅體現14-3-3σ基因的轉錄水平。從RNA 到蛋白質還需要經過轉錄后修飾和翻譯階段。因此，為了深入了解14-3-3σ 基因在胃癌發生、發展中可能起到的重要生物學作用，本研究主要是集中在蛋白質水平對14-3-3σ 蛋白進行探討， 這種研究層次的差別也可能導致得出與王鳳超等[14]研究相異的結果。

本研究結果表明，14-3-3σ 蛋白在胃癌中的表達與患者的年齡、性別、病理分級、浸潤深度、有無淋巴結轉移、臨床分期等均無顯著相關性，這與王鳳超等[14]在mRNA 水平上的研究結果一致。統計結果顯示，14-3-3σ 蛋白陽性表達的差異與腫瘤大小存在顯著相關性，表明該蛋白的表達與細胞增殖或凋亡存在某種聯系。腫瘤體積的大小是惡性腫瘤的重要生物學特性，近年來的研究也表明，腫瘤大小可作為胃癌的重要預后指標[15-17]。而14-3-3σ 蛋白與胃癌細胞增殖和凋亡能力的相關性及其可能涉及的具體分子機制是下一步研究的重點。

綜上所述，14-3-3σ 蛋白的過表達可能參與了胃癌的發生、發展。考慮到14-3-3σ 蛋白表達與腫瘤大小的密切相關性，推測其可能與胃癌細胞的增殖或凋亡存在一定的聯系。本研究為闡明胃癌發生、發展的分子機制提供了有效的實驗依據，但14-3-3σ 蛋白參與胃癌細胞增殖或增殖的相關具體分子機制尚待進一步深入研究。

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