濃縮乳清蛋白粉溶液熒光光譜特性研究

趙 挺

（蚌埠醫學院 數理教研室，安徽 蚌埠 233030）

濃縮乳清蛋白粉是當今最為常見的蛋白質補充來源，被廣泛應用于嬰幼兒配方奶粉、運動員營養補劑，中老年保健品的生產.食品安全與原料質量密切相關，因此加強濃縮乳清蛋白粉的質量檢測十分必要.我國市場上的濃縮乳清蛋白粉多從外國進口，這使得我們無法從生產源頭監控其質量.同時隨著人們對乳清蛋白粉日漸追捧，不法商販往往通過摻假的方式（如加入大豆蛋白，植脂末等），追求暴利.而當前檢測濃縮乳清蛋白粉的方法（見國標GBT11674-2010），大都是化學方法，其檢驗過程步驟繁瑣，需時較長，這就需要找到一種快速有效的檢測方法.熒光光譜技術可以快速提供待測樣品物質成分，分子結構以及所處狀態等大量信息.本文利用熒光光譜技術，分析濃縮乳清蛋白粉的熒光特性和形成機理.希望通過研究，可以為濃縮乳清蛋白粉的質量檢測，提供一定的方法參考和理論依據.

1 濃縮乳清蛋白粉水溶液的三維熒光光譜

我們選擇了3種品牌的進口濃縮乳清蛋白粉作為研究對象.通常人們在食用以濃縮乳清蛋白粉作為原料的類似食品(如嬰兒配方奶粉等)時，往往是加水沖調制成飲料.為了能夠更加接近濃縮乳清蛋白粉的實際存在環境，我們以濃縮乳清蛋白粉水溶液作為研究對象.由于三維熒光光譜法可以同時記錄被測量樣本熒光光強與激發和發射波長之間的關系，能夠較全面的反映樣本的熒光特性[1]，為此我們首先檢測濃縮乳清蛋白粉水溶液的三維熒光光譜.

1.1 實驗儀器

本文所有實驗均采用天津市津維電子儀表有限公司生產的F-450熒光分光光度計.

1.2 樣品制備及實驗方法

實驗樣品為市場上購買的三個品牌的濃縮乳清蛋白粉：

（1）Fonterra濃縮乳清蛋白粉，生產商為新西蘭恒天然集團.

（2）Glanbia濃縮乳清蛋白粉，生產商為美國愛爾蘭哥蘭比亞營養有限公司.

（3）Hilmar濃縮乳清蛋白粉，生產商為美國希爾馬奶酪公司.

這三種蛋白粉中的蛋白質含量均標稱達到80%.在前期的實驗中發現，濃度為1mg/ml的濃縮乳清蛋白粉水溶液的熒光強度最大，故我們以實驗室去離子水為溶劑，分別將樣品配制成濃度為1mg/ml的濃縮乳清蛋白粉水溶液.

實驗中設置激發波長范圍：240nm～310nm.為避免散射光的影響，設定起始發射波長為330nm，以此避開一級散射；設定最終發射波長為460nm，避開二級散射.同時設定激發波長和發射波長的掃描步距皆為1nm；激發與發射的狹縫縫寬均為5nm；掃描速12000nm/min.

1.3 實驗結果

在實驗中分別得到了三個品牌濃縮乳清蛋白粉水溶液在濃度為1mg/ml時對應的三維熒光光譜.我們分別采用三維投影圖和等高線圖兩種方式表示出來，見圖1.

圖1 不同品牌的三維熒光光譜和等高線圖

從圖中可以看出，三種不同品牌的濃縮乳清蛋白粉水溶液熒光光譜的譜峰分布規律很相似，當激發光波長改變時，發射峰波長都是在340nm附近，只是譜峰的強度略有不同，其中Glanbia的強度相對較大，其他兩個品牌強度則稍弱，根據熒光的產生原理，當分子從第一激發態的最低振動能級躍遷至基態的任意能級時產生熒光，因此熒光的產生和分子被激發至哪個能級無關，即發射峰與激發波長無關[1]，所以我們判斷340nm附近的發射峰應是熒光峰.

當激發波長在240nm到260nm范圍內，熒光峰的強度隨著激發波長的增加而變強.當激發波長超過260nm時，熒光峰的強度開始迅速變大，在300nm附近達到最大值，之后開始減弱，我們推斷激發峰處于300nm附近.

為了更準確地確定激發峰和發射峰的具體位置，我們又測量了三個品牌在發射光為340nm時的激發譜和激發波長為280nm時的發射譜，如圖2和圖3所示.通過比較可以看出，3種品牌的濃縮乳清蛋白粉水溶液，激發譜的范圍主要都在240nm～320nm，激發峰在298nm處；發射譜都在300nm～500nm范圍內，發射峰在336nm處.

圖2 不同品牌在發射光為340nm時的激發譜

圖3 不同品牌在激發光為280nm時的發射譜

由此可以確定，三者水溶液的激發譜和發射譜雖然強度不同，但變化規律相似，說明三個品牌的成分幾近相同，所以在下面的實驗中我們將Glanbia濃縮乳清蛋白粉水溶液作為樣本.

1.4 實驗結果分析

根據濃縮乳清蛋白粉的食品成分標簽，我們發現濃縮乳清蛋白粉主要成分為蛋白質以及少量的乳糖和脂肪，我們知道蛋白質可以發出內源熒光，而色氨酸﹑酪氨酸﹑苯丙氨酸三者的殘基正是這種熒光的主要來源[2]，處于游離態時，這三種熒光生色團對應的熒光峰，見表1：

表1 3種生色團的熒光特征峰[2]

其中苯丙氨酸熒光效率最低，一般很難發現其熒光，因此常見的蛋白質熒光主要來自于其他兩種氨基酸殘基，蛋白質中的酪氨酸殘基，其熒光特征峰位于313nm[2]；而色氨酸殘基對所處微環境的改變十分敏感，其熒光峰在325nm-352nm范圍內變動[3].在實驗中，三個品牌的熒光峰都位于336nm處，推測此熒光峰主要來自于蛋白質中的芳香族氨基酸殘基.

2 不同濃度濃縮乳清蛋白粉水溶液的熒光光譜

不同濃度的濃縮乳清蛋白粉水溶液，其內部的熒光團所處環境以及溶液的透光能力都會有所變化，即溶液熒光特性會隨著溶液濃度的改變而發生變化.因此我們又測量了不同濃度下的發射譜，確定了濃度與熒光強度，以及熒光峰位置之間的關系.

2.1 樣品制備及實驗方法

我們利用電子天平稱取濃縮乳清蛋白粉，用少量去離子水溶解后移入容量瓶，分別配制成濃度為0.1mg/ml﹑0.2mg/ml﹑0.4mg/ml﹑0.6mg/ml﹑0.8mg/ml﹑1mg/ml﹑2mg/ml﹑4mg/ml﹑6mg/ml﹑8mg/ml﹑10mg/ml﹑20mg/ml﹑40mg/ml、60mg/ml﹑80mg/ml﹑100mg/ml共 16份樣品，之后用滴管將溶液移入石英皿，測量相應的發射譜.

根據上節實驗結果，我們將熒光分光光度計設置為：激發波長280nm；發射波長范圍：300nm～500nm；步距1nm.激發和發射狹縫縫寬和掃描速度設置與上節相同.

2.2 實驗結果

2.2.1 熒光光強與濃度的變化關系

我們將280nm光激發的、不同濃度的濃縮乳清蛋白粉水溶液熒光發射光譜，表示成三維熒光光譜的形式，如圖4所示.從圖中可以看出，隨著濃度不斷增加，溶液熒光強度先變大再變小，溶液濃度超過40mg/ml后，熒光強度十分微弱.為了便于進一步分析，我們將不同濃度段熒光強度的變化情況列于圖5中.

圖4 濃度-發射三維熒光譜

由圖5-a可以看出，當濃縮乳清蛋白粉水溶液濃度在0.1mg/ml～1mg/ml范圍時，熒光強度不斷增強，其中在0.1mg/ml～0.4mg/ml時，熒光強度變化最為迅速，強度擴大35倍.根據熒光強度與溶液濃度的關系有[1]：

當溶液濃度很低，公式近似為：

在圖5-a中還可以看出，在0.1mg/ml～0.4mg/ml范圍內，由于溶液濃度c較小，此時熒光強度與溶液濃度之間的關系符合(1-1)式，即兩者成線性變化趨勢.當超過0.4mg/ml后，由于濃度c較大，此時熒光強度又符合(1-2)式的規律，其增加速度趨緩，當濃度達到1mg/ml時，由于式(1-1)中的e-abc已趨近于零，此時熒光強度達到了最大值.溶液濃度大于1mg/ml時，如圖5-a所示，熒光強度開始減少，即溶液進入熒光淬滅階段，其中在1mg/ml～2mg/ml范圍內下降速度變得緩慢.當濃度超過8mg/ml時，熒光強度又開始突然迅速減少，大于40mg/ml時，如圖5-c所示，溶液熒光強度已十分微弱.

圖5 不同濃度下的發射譜和濃度-熒光強度曲線

2.2.2 熒光峰與濃度的變化關系

觀察圖5可以發現，當濃縮乳清蛋白粉水溶液濃度小于8mg/ml時，其發射峰固定在336nm處.濃度超過8mg/ml之后，熒光峰持續紅移.為了表示此時熒光峰位置與溶液濃度之間的關系，我們給出了圖6，從圖中可以發現，在10mg/ml～60mg/ml范圍內，熒光峰呈線性的移動變化趨勢.

圖6 不同濃度下發射峰的位置

2.3 實驗結果分析

在實驗中溶液濃度超過1mg/ml之后溶液熒光減弱，分析認為此現象由以下幾點因素造成：

當濃度較高時，溶液中雜質引起的內濾效應變強，降低了激發光的強度；其次隨著濃度的增大，位于比色皿前段的熒光物質對于入射光的吸收變強，而中后段的熒光物質受到的入射光減弱，使得處于比色皿的中段的的儀器探測窗口接受到的熒光減弱[1].當濃度超過40mg/m l時，溶液熒光強度十分微弱，由于過渡金屬離子會與蛋白質分子發生配合作用，產生的配合物往往是不發光的，此即是過渡金屬離子對蛋白質溶液熒光的靜態猝滅作用[4].表2標明了濃縮乳清蛋白粉中主要的礦物質含量，從中可看出，雖然經過超濾等工序，但是濃縮乳清蛋白粉仍然存在有鈉，鈣，鉀，鎂，鐵等微量的金屬離子.表2中Fe為過渡金屬離子[5]，當其濃度增大時，造成了溶液發生靜態猝滅.

表2 濃縮乳清蛋白粉中主要離子及其含量

一些金屬離子會與芳香族配位體產生配合作用，在配位體的配位位置上產生正極化作用，從而使熒光峰紅移[6].根據上節實驗的結論，濃縮乳清蛋白粉水溶液的熒光主要來自于蛋白質中的芳香族氨基酸殘基，因此我們認為當溶液濃度增大時，金屬離子與殘基這種配合作用會越來越明顯，從而使得熒光峰不斷紅移.

3 小結

本文測量了市場上主要3個品牌的濃縮乳清蛋白粉水溶液的三維熒光光譜，確定了其激發峰和發射峰的位置，之后以Glanbia濃縮乳清蛋白粉水溶液為樣本，測量了不同濃度下的發射譜，確定了濃度與熒光強度，以及熒光峰位置之間的關系，并對其產生機理做了分析.通過研究我們發現：

3.1 三個品牌的濃縮濃縮乳清蛋白粉水溶液，除強度以外，其三維熒光光譜分布規律相同，濃度為1mg/ml時，三個品牌激發譜的范圍主要都在240nm到320nm，激發峰都在298nm處；發射譜都在300nm到500nm范圍內，發射峰都在336nm處.經分析認為：濃縮乳清蛋白粉水溶液的發射峰，主要來自于蛋白質中的芳香族氨基酸殘基.

3.2 280nm光激發的不同濃度的濃縮乳清蛋白粉水溶液熒光發射譜，在濃度小于1mg/ml時熒光強度存在線性增大，之后進入了熒光淬滅階段.濃度小于8mg/ml時，發射峰均在336nm處，符合熒光發射特征.濃度超過8mg/ml之后熒光峰持續紅移，在10mg/ml-60mg/ml范圍內熒光峰的移動成線性變化趨勢.我們認為含有芳族氨基酸殘基的蛋白質與微量金屬離子發生的配合作用，引起的正極化作用，使得濃度增大時熒光峰不斷紅移.當濃度超過40mg/ml時，溶液熒光強度十分微弱，我們提出這是濃縮乳清蛋白粉溶液中的過渡金屬離子與蛋白質的配合作用，造成溶液發生靜態猝滅所致.

〔1〕許金鉤，王尊本.熒光分析法[M].北京:科學出版社，2007.7-13，154-160.

〔2〕陶慰孫.蛋白質分子基礎[M].北京:人民教育出版社，1981.229.

〔3〕王守業，徐小龍，劉清亮，等.熒光光譜在蛋白質分子構象研究中的應[J].化學進展，2001，13(4):258.

〔4〕黃淑萍，陳亮，李玉紅.比較與研究金屬離子與三種蛋白的配位機理 [J].光譜學與光譜分析，1995，15(5):85-87.

〔5〕曹錫章，宋天佑，王杏喬.無機化學[M].北京:高等教育出版社，1994.931-940.

〔6〕陳國珍，黃賢智，鄭朱梓，許金鉤，王尊本.熒光分析法[M].北京:科學出版社，1990.108-109.