Cocktail法評價清熱養心顆粒對大鼠體內P450酶活性的影響研究

吳 磊， 陸 超， 戴國梁， 王 珂

（1.南京中醫藥大學附屬醫院；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210029；3.徐州市中心醫院，江蘇 徐州 221009）

細胞色素P450酶(CYP450)是機體內最重要的代謝酶系統，可催化多種內源性、外源性化合物的氧化反應，在藥物和致癌物代謝活化過程中具有非常重要的作用.有些藥物經CYP450酶系代謝后，轉化為活性代謝物，藥效增強；有些藥物經CYP450代謝后，藥效降低或消失[1,2].肝臟是藥物代謝的主要場所，因此，評價外源物對肝臟藥物代謝酶的誘導或抑制作用尤為重要[3,4]，已有大量實驗報道化學合成藥物誘導或抑制CYP450酶活性，而有關中藥對CYP450影響的報道并不多見[5].

清熱養心顆粒由金銀花、黃連、酒黃精、百合、山豆根和甘草組方而成，全方具有清熱解毒，養心安神之功效，是新型的治療病毒性心肌炎藥物[6].臨床廣泛用于治療熱毒侵心、氣陰兩傷、心神失寧的病毒性心肌炎以及合并心律失常、心悸胸悶等.

本實驗采用"Cocktail"探針藥物法，通過考察清熱養心顆粒對大鼠體內CYP450酶5種亞型（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1）的影響，提示與相關藥物存在相互作用的可能性，指導那些有多重代謝途徑的藥物的劑量設計，降低和避免臨床聯合用藥時由于相互作用引起的不良反應發生.

1 材料

1.1 藥品與試劑

清熱養心顆粒（江蘇省中醫院制劑，批號1307001，規格：10g/袋），注射用奧美拉唑鈉（江蘇奧賽康藥業股份有限公司委托杭州澳亞生物技術有限公司生產，批號14010126，規格：含奧美拉唑40mg/支），甲苯磺丁脲(Tolbutamide)對照品（Sigma，017K1025），氯唑沙宗(chlorzoxazone)對照品（Sigma，017K1385），茶堿 (theophylline)對照品（Sigma，T1633），奧美拉唑(omeprazole)對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100367-201104），右美沙芬(dextromethorphan)對照品（Sigma，097K11348），內標吡羅昔康（中國藥品生物制品檢定所，批號：100177-200603），替硝唑（中國藥品生物制品檢定所，批號：100336-200402），甲醇、乙腈為色譜純（Merck Company），二氯甲烷為分析純，實驗用水為超純水.

1.2 儀器

Waters Quattro Micro液質聯用儀(美國Waters公司)，色譜工作站：Masslynx 4.0；Mettler AE240電子天平（梅特勒-托利多 (上海)有限公司）；Micro-17R冷凍離心機 (美國 Thermo公司)；Drict-Q5超純水機 (法國Millipore公司)；WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

1.3 動物

雄性 SD大鼠，12只，體重（240±40）g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(浙)2008-0033.

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合探針的配制

稱取甲苯磺丁脲20mg，氯唑沙宗60mg，茶堿25mg，右美沙芬30mg，固體用0.5%CMC-Na研磨混勻后后，全部轉移至10mL容量瓶中，注射用奧美拉唑鈉粉針劑1支（40mg），用生理鹽水定容.混合探針臨用前配制，現配現用.

2.1.2 混合標準溶液及質控溶液的配制

精密稱取甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶堿、奧美拉唑、右美沙芬各對照品適量，分別溶于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得各對照品儲備液，備用.另精密移取各儲備液適量于同一10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為76.8、112.64、28.672、2.048、1.536μg·mL-1的 混 合對照品儲備溶液.取該混合對照品儲備溶液適量，倍比稀釋成系列不同濃度的混合標準溶液，冷藏于-4℃備用.

吸取上述甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶堿、奧美拉唑、右美沙芬混合標準溶液適量，得質控高濃度混合標液，濃度分別為 38.4、56.32、14.336、1.024、0.768μg·mL-1；質控中濃度標液，濃度分別為 4.8、7.04、1.792、0.128、0.096μg·mL-1；質控中濃度標液，濃度分別為 0.3、0.44、0.112、0.008、0.006μg·mL-1，所有標液冷藏于-4℃備用.

2.1.3 混合內標的配制

精密稱取替硝唑和吡羅昔康各對照品適量，分別溶于10mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，得各對照品儲備液.另精密移取各儲備液適量于同一10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，使得替硝唑和吡羅昔康的終濃度分別為1.2、10.6μg·mL-1.冷藏于-4℃冰箱備用.

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB C18(2.1×150mm,5μm)（美國Agilent公司）；保護柱：Agilent EclipaseXDB2C8(2.1mm×12.5mm,5μm)；流動相：乙腈(A)：0.1%甲酸 -4mmol/L甲酸銨(B)=75:25；流速 0.2mL·min-1；進樣量：5μL；柱溫：23℃.

2.3 質譜檢測條件

離子化方式為電噴霧 (ESI)；多反應監測（MRM）；正負離子同時檢測.檢測電壓：3.5kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣體流速：500L·h-1.各成分的檢測離子，質核比，錐孔電壓及碰撞氣能量見表1.

表1 5種探針藥物及內標質譜參數

2.4 動物給藥方法

12只大鼠隨機平均分為兩組，即實驗組和對照組，實驗組每天上午灌胃清熱養心顆粒4g·kg-1，連續給藥10天，對照組正常飼養.第10天晚上，大鼠禁食不禁水，于第11天早晨兩組大鼠均灌胃給予混合探針藥物10mL·kg-1，于給藥前和給藥后5、10、20、40min和 1、1.5、2、2.5、3、5、8、12、24h從 眼底靜脈叢采血約0.4mL，置肝素抗凝試管.全血4000r·min-1離心10min后，吸取上層血漿于-20℃保存待用.整個實驗過程盡量避光.

2.5 大鼠血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品100μL，加入1.3.3項下配制的混合內標20μl，漩渦30s混勻，加入800μL二氯甲烷，漩渦3min，于4℃，12000r·min-1離心10min，吸取下層有機層 700μl，N2氣吹干，用 75%乙腈 100μL復溶，12000r·min-1離心 5min，吸取5μL進樣分析.

2.6 數據處理

藥動學參數采用DAS1.0軟件計算，給藥前后各探針藥動學參數的差異用SPSS 11.5統計，以配對t檢驗進行分析，P<0.05表示差異有統計學意義.

3 結果

3.1 色譜行為

本色譜條件下，甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶堿、奧美拉唑、右美沙芬和內標替硝唑、吡羅昔康的保留 時 間 分 別 在 2.53、2.42、2.04、2.31、3.26、2.08、2.64min.5種探針藥物與2種內標分離良好，互不干擾且血漿中內源性雜質不影響分析物的測定，基線平穩（見圖1）.本方法具有良好的特異性和分離度能準確測定血漿中各探針藥物的濃度，重現性好.

3.2 標準曲線

取空白血漿100μL，加入2.1.2項下配制的不同濃度的混合標液10μL，再加入2.1.3項下混合內標20μL，按“2.5大鼠血漿樣品處理方法”處理.分別計算各成分的峰面積(Ai)與相應內標的峰面積(As)的比值Y，以比值Y對探針藥物的進樣質量濃度進行線性回歸，得回歸方程.見表2.

表2 5種探針藥物的線性關系及靈敏度考察(μg·mL-1,n=5)

圖1 各分析物及內標的LC-MS/MS圖譜

3.3 精密度

考察日內精密度與日間精密度.取大鼠血漿100μL，分別加入10μL高、中、低質控標液，每個濃度平行5份，按“2.5血漿樣品處理”方法處理樣品，取5μL進樣分析，根據隨行標準曲線計算各分析物檢測值，日內重復測定5次，平行測定3天.結果表明其日內和日間精密度均小于10%，準確度均在90%～115%之間.

3.4 提取回收率

按取大鼠血漿100μL，同上配制高、中、低3個不同濃度含藥血漿質控樣品，按“2.5血漿樣品處理方法”處理樣品，記錄分析物峰面積Ax.另以流動相配制相同進樣濃度的含藥溶液，記錄分析物峰面積As.提取回收率計算公式如下：R(%)=Ax/As×8/7×100%，各成分提取回收率（Recoveries）結果見表3.

3.5 介質效應

表3 各檢測成分的提取回收率及介質效應(n=3）

取空白血漿加入800μL二氯甲烷，旋渦振蕩3min,4℃，12000r/min離心10min，吸取下層有機層700μL，N2氣吹干，分別精密加入3個濃度混合質控標液混合標液10μL，再加入2.1.3項下混合內標20μL，N2氣吹干，用75%乙腈100μL復溶，12000r/min離心5min，吸取5μL進樣分析，計算介質效應ME(%).介質效應結果見表3.

3.6 樣品穩定性考察

考察5種探針藥物標品及含藥血漿在不同保存條件下的穩定性.標準品的甲醇溶液可在4℃冰箱保存2個月以上.含藥血漿樣品在-40℃冰箱內冷凍保存一個月樣品穩定.血漿樣品在室溫（避光保存）12h內穩定.血漿樣品反復凍融3次后測定，實驗結果穩定.

3.7 藥動學參數

3.7.1 5種探針藥物的藥-時曲線

實驗組和對照組大鼠分別灌胃混合探針藥物，按1.5項方法操作，測得5種探針藥物的血藥濃度，結果見圖2.

圖2 5種探針藥物給藥前后的藥-時曲線

3.7.2 6種探針藥物的藥動學參數

各種成分的藥代動力學數據經中國藥理學會推薦的DAS1.0程序處理，分別按單室、二室、三室模型以最小二乘法擬合，結果表明甲苯磺丁脲符合一室模型（W=1/CC），其他均符合二室模型（W=1/CC），5種探針藥物的生物半衰期（T1/2）、表觀分布容積（Vd/F）、機體總清除率（CL/F）、達峰時間（Tmax）、最大血藥濃度（Cmax）、藥時曲線下面積（AUC）見表4.

表4 5種探針藥物在大鼠體內的藥動學參數(±S，n=6)

表4 5種探針藥物在大鼠體內的藥動學參數(±S，n=6)

探針 參數 給藥前 給藥后甲苯磺丁脲 T1/2(h) 5.38±1.21 4.26±0.87 Vd/F(L·kg-1)0.009±0.001 0.007±0.002 Tmax(h) 3.21±0.92 2.82±1.02 Cmax(mg·L-1) 31.61±2.35 27.12±12.a AUC0-t(mg·L-1·h)429.11±41.72 330.67±44.32a AUC0-∞(mg?L-1·h)471.48±42.56 347.30±46.45a氯唑沙宗 T1/2(h) 2.37±0.76 2.04±0.63 Vd/F(L·kg-1) 4.27±1.23 5.41±1.92 CL/F(L·h-1·kg-1)1.49±0.38 2.05±0.74 Tmax(h) 0.67 0.67 Cmax(mg·L-1) 17.93±1.32 12.19±2.03a AUC0-t(mg·L-1·h)45.91±9.81 32.46±10.23 AUC0-∞(mg·L-1·h)46.93±10.76 33.49±11.51

與給藥前比aP<0.05

4 討論

本實驗采用“Cocktail”法考察清熱養心顆粒對大鼠體內CYP450酶5種亞型的影響，“Cocktail”方法的建立首先應排除同時使用的各種探針底物在體內的代謝性相互作用，保持其作用的專屬性；另外為有效評估各種探針底物在給藥前后的藥動學參數變化，必須保證每種探針底物有選擇地作用于一種酶，且具有高度敏感性[7-9].在本實驗采用自身對照的方法，將試驗用動物個體間的遺傳代謝性差異降到最低，同時參考文獻[7,10-11]并驗證排除了5種探針藥物(甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶堿、奧美拉唑、右美沙芬)在體內存在潛在代謝性相互作用的可能性，實驗設計基本符合“Cocktail”法的條件，因此可以同時給予此5種探針底物以評估艾迪注射液對大鼠體內P450酶活性的影響.

由表4可以看出，連續給予清熱養心顆粒10天后，氯唑沙宗、奧美拉唑和右美沙芬的藥動學行為無顯著性變化，提示清熱養心顆粒對大鼠CYP2E1、CYP2C19及CYP2D6活性基本無影響；而清熱養心顆粒能使甲苯磺丁脲和茶堿的AUC顯著降低（P<0.05），分別降低至給藥前的0.77和0.60倍，提示艾迪注射液能誘導大鼠CYP2C9和CYP1A2酶的活性.

因此在臨床上使用清熱養心顆粒的同時，合并使用經CYP2C9和CYP1A2代謝的藥物，應充分考慮兩者合并用藥的給藥劑量對合用藥物代謝的影響，必要時應注意調整合用藥物的給藥劑量，為臨床合理用藥提供依據，確保臨床療效，同時將可能出現的不良代謝性藥物相互作用降到最低程度.

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