大黃鞣質對大鼠創傷性腦損傷繼發腦水腫抑制作用的研究*

張 鉑王 兵王勇強曹書華△

（1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津市第一中心醫院，天津 300192；3.天津市環湖醫院，天津 300060）

·研究報告·

大黃鞣質對大鼠創傷性腦損傷繼發腦水腫抑制作用的研究*

張 鉑1，2，3王 兵2王勇強2曹書華2△

（1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津市第一中心醫院，天津 300192；3.天津市環湖醫院，天津 300060）

目的觀察大黃鞣質對SD大鼠創傷性腦損傷繼發腦水腫的抑制作用并探討其作用機制。方法采用Feeney自由落體墜擊法制備大鼠創傷性腦損傷模型，腹腔注射大黃鞣質，測定給藥后大鼠腦組織含水量、血管通透性及SOD水平的變化，采用免疫組織化學法和蛋白質免疫印跡法測定大鼠腦組織AQP4和GFAP表達的變化。結果與模型組相比，給藥組大鼠腦組織含水量顯著下降（P＜0.05），腦組織SOD水平顯著提高（P＜0.05），血管通透性明顯下降（P＜0.05）；免疫組化法檢測給藥組大鼠AQP4和GFAP的陽性細胞數減少，顏色變淺，陽性細胞表達評分明顯低于模型組各亞組（P＜0.01）；蛋白印跡免疫試驗法檢測給藥組AQP4和GFAP的陽性表達下降，其表達量與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論大黃鞣質對大鼠創傷性腦損傷繼發腦水腫的抑制作用與降低血管通透性、增加SOD水平和降低水通道蛋白AQP4和GFAP的表達有關。

大黃鞣質 腦損傷 腦水腫 抑制作用

創傷性腦損傷（TBI）是重癥醫學領域的常見疾病，該病致死、致殘率高，是外傷性死亡的首要原因［1］。創傷性腦水腫是創傷性腦損傷的繼發癥，主要包括血管源性腦水腫和細胞毒性腦水腫兩種類型，是創傷性腦損傷后的一種病理、生理反應，抑制腦創傷后繼發的腦組織水腫是降低腦創傷危險因素的關鍵。鞣質是存在于植物體內的多酚類化合物，可有效清除體內自由基，防止脂質氧化對機體造成的損傷，能與蛋白質結合產生沉淀，表現出良好的收斂作用。鞣質是大黃的重要活性成分，大黃鞣質在大黃生藥材中含量達30%，其單體成分主要包括沒食子酸（gallic acid）和d-兒茶素（d-catechin）［2］。研究顯示，大黃鞣質具有抗脂質過氧化、抗炎、抗過敏及止血收斂等多種作用［3］，但大黃鞣質用于減輕創傷性腦水腫的研究鮮有報道。本文系統報道了大黃鞣質單體沒食子酸、d-兒茶素對創傷性腦損傷的保護作用及其作用機制，為大黃鞣質在創傷性腦損傷中的應用研究提供參考。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠120只 （由天津醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK2014-0003），6～8周齡，體質量220～250 g。

1.2 藥物與試劑 沒食子酸（純度＞98%，成都植標化純生物技術有限公司）；d-兒茶素（純度＞98%，成都植標化純生物技術有限公司）；Evans Blue（北京索萊）；蘇木素染色液（北京賽馳生物科技有限公司）；甲醛（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；苯甲基磺酰氟（分析純，天津永大化學試劑有限公司）。

1.3 模型制備 采用Feeney自由落體法制作大鼠腦損傷模型，SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/ 100 g，麻醉后將大鼠俯臥固定于手術臺上，在左側顱腦實施開顱手術，行頭部正中縱行切口，剝離骨膜，暴露前囟和矢狀縫；在大鼠前囟后方1.5 mm，中線右側2.5 mm處鉆一直徑為5 mm的骨洞，保持硬腦膜完整；將自由落體裝置底座置于右頂部骨窗的硬腦膜表面，20 g砝碼從30 cm高處自由墜落至金屬圓柱體表面，擊中打擊棒，下陷深度為0.25 cm，致大鼠中度腦損傷。用骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，即得大鼠腦創傷模型。假手術模型只開顱、手術、縫合，不做墜擊創傷。

1.4 分組與給藥 將120只SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組和給藥組，每組以腦損傷后時間點再隨機分為12、24、48 h和72 h 4個亞組，每個亞組10只。假手術組、模型組腹腔注射生理鹽水10 mL/（kg·24 h），給藥組于創傷模型制備完成后立即腹腔注射含沒食子酸和d-兒茶素的生理鹽水溶液10 mL/（kg·24 h），相當于給藥沒食子酸和d-兒茶素劑量100 mg/（kg·24 h）。

1.5 檢測指標 （1）對腦組織含水量的影響。分別于給藥后12、24、48、72 h，開顱取損傷側大腦半球，準確稱取濕重后，置于100～110℃的烤箱中烘烤24 h至恒重，稱取質量，記錄干重，以假手術組、模型組為對照，比較給藥后腦組織含水量的變化。按下式計算腦組織含水量：腦組織含水量 （%）=（濕重-干重）／濕重× 100%。（2）對腦血管通透性的影響。伊文氏藍標準曲線：稱取伊文氏藍8 mg，采用生理鹽水定容至50 mL，分別取適當體積的伊文氏藍加至甲酰胺溶液中，質量濃度分別為10、8、4、2、1 μg/mL，60℃孵育24 h，設定檢測波長632 nm，測定A值，計算線性回歸方程，以質量濃度為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標，線性回歸，得方程y=0.123x+0.015，r=0.9998，在1～10 μg/mL范圍內，質量濃度與吸收度值線性關系良好。于取樣點前2 h經股靜脈緩慢注入2.5%伊文氏藍 （EB，0.2 mL/ 100 g），麻醉大鼠，分別于給藥12、24、48、72 h時間點，開胸經左心室至升主動脈插管，生理鹽水快速沖凈血液后斷頭取腦，取損傷側大腦半球腦組織，浸泡在甲酰胺溶液中，60℃避光水浴24 h，取出組織，浸出液4000 r/min離心30 min，取上清液，按上述方法測定吸收值，計算EB含量（μg/g濕重腦組織），以假手術組、模型組為對照，比較給藥后腦血管通透性的變化。（3）對腦組織超氧化物歧化酶（SOD）水平的影響。分別于給藥12、24、48、72 h時間點，斷頭處死大鼠，取損傷側大腦半球皮層組織100 mg。置于9.9 mL pH7.4的PBS液中，高速勻漿后，20000 r/min離心10 min，取上清液5 μL，按試劑盒法測定SOD活性［4］。（4）對腦組織AQP4和GFAP表達的影響。采用IHC檢測腦組織AQP4和GFAP的表達［5］，根據腦組織細胞核或細胞質中有棕黃色或棕褐色顆粒的細胞判斷為AQP4或GFAP表達陽性細胞。對各組AQP4表達評分，先按陽性細胞比例將0～1%、1%～10%、10%～50%、50%～80%、80%～100%分別記為0、1、2、3、4分；再按染色強度將無、弱、中、強分別記為0、1、2、3分，將兩者得分相乘后進行統計學分析。采用蛋白質免疫印跡試驗，分別以AQP4和GFAP和內參β-肌動蛋白（β-actin）的積分吸光度（A）值比值進行統計學分析［6］。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組腦組織水含量比較 見表1。與假手術組相比，模型組大鼠腦損傷后12、24、48、72 h的腦組織水含量均顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組大鼠的腦組織水含量均顯著下降（P＜0.05），與假手術組相當。

表1 各組創傷性腦損傷大鼠腦組織水含量比較（%，±s）

表1 各組創傷性腦損傷大鼠腦組織水含量比較（%，±s）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h假手術組 1 0模型組 1 0 7 7 . 9 3 ± 0 . 1 8 7 7 . 9 8 ± 0 . 2 0 7 7 . 9 0 ± 0 . 4 1 7 7 . 6 4 ± 0 . 5 1 8 0 . 4 9 ± 0 . 4 9*8 1 . 5 1 ± 0 . 6 0*8 0 . 3 6 ± 0 . 6 2*7 8 . 7 1 ± 0 . 4 1*給藥組 1 0 7 8 . 3 9 ± 0 . 5 7△7 9 . 8 7 ± 0 . 4 3△7 8 . 9 4 ± 0 . 4 8△7 7 . 9 3 ± 0 . 6 7△

2.2 各組腦血管通透性比較 見表2。模型組大鼠腦損傷后12、24、48、72 h的腦血管通透性與假手術組相比均顯著上升（P＜0.01）；給藥組腦血管通透性與模型組相比顯著下降（P＜0.05），與假手術組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組創傷性腦損傷大鼠對腦血管通透性比較（μg/g，±s）

表2 各組創傷性腦損傷大鼠對腦血管通透性比較（μg/g，±s）

組別 n 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h假手術組 1 0模型組 1 0 2 . 7 2 ± 0 . 7 3 2 . 7 1 ± 0 . 6 9 2 . 7 2 ± 0 . 7 1 2 . 7 1 ± 0 . 7 2 6 . 1 0 ± 0 . 6 8**6 . 0 9 ± 0 . 6 7**6 . 1 1 ± 0 . 6 7**6 . 1 0 ± 0 . 6 6**給藥組 1 0 4 . 1 2 ± 0 . 3 1△4 . 1 1 ± 0 . 3 0△4 . 1 3 ± 0 . 2 9△4 . 1 2 ± 0 . 3 2△

2.3 各組腦組織SOD水平比較 見表3。與假手術組相比，模型組大鼠腦損傷后12、24、48、72 h的SOD水平顯著下降（P＜0.01），與模型組相比，給藥組大鼠的SOD水平顯著上升（P＜0.01），與假手術組相當。

表3 各組創傷性腦損傷大鼠腦組織SOD水平比較（U/mg，±s）

表3 各組創傷性腦損傷大鼠腦組織SOD水平比較（U/mg，±s）

組別 n 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h假手術組 1 0模型組 1 0 1 2 7 . 2 2 ± 0 . 3 2 1 2 7 . 3 1 ± 0 . 3 4 1 2 7 . 2 4 ± 0 . 3 1 1 2 7 . 3 1 ± 0 . 2 9 1 0 1 . 1 4 ± 0 . 4 1**1 0 2 . 2 1 ± 0 . 2 7**1 0 1 . 5 6 ± 0 . 3 6**1 0 3 . 5 3 ± 0 . 4 3**給藥組 1 0 1 2 3 . 2 7 ± 0 . 3 7△△1 2 4 . 3 2 ± 0 . 3 9△△1 2 3 . 4 9 ± 0 . 2 7△△1 2 3 . 5 8 ± 0 . 2 9△△

圖1 各組大鼠腦組織AQP4陽性細胞表達

圖2 各組大鼠腦組織GFAP陽性細胞表達

表4 各組大鼠腦組織AQP4和GFAP的表達比較（分，±s）

表4 各組大鼠腦組織AQP4和GFAP的表達比較（分，±s）

1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h 2 . 3 3 ± 0 . 2 2 4 . 2 8 ± 0 . 5 3 3 . 9 9 ± 0 . 1 9 3 . 8 7 ± 0 . 5 7 3 . 2 1 ± 0 . 1 1 5 . 0 0 ± 0 . 8 2 4 . 9 8 ± 0 . 3 9 4 . 5 3 ± 0 . 6 2 3 . 3 4 ± 1 . 2 1*6 . 5 8 ± 1 . 3 2*6 . 3 7 ± 1 . 1 9*5 . 7 8 ± 1 . 5 3*（n = 1 0） G F A P 4 . 8 3 ± 1 . 2 9**7 . 8 1 ± 1 . 7 5**7 . 1 7 ± 1 . 7 6**6 . 7 3 ± 1 . 6 1**給藥組 A Q P 4 2 . 5 6 ± 0 . 4 7△4 . 5 1 ± 0 . 5 2△4 . 1 3 ± 0 . 4 1△4 . 1 1 ± 0 . 3 5△（n = 1 0） G F A P 3 . 3 7 ± 0 . 2 6△△5 . 9 2 ± 0 . 7 1△△5 . 2 7 ± 0 . 6 5△△4 . 9 8 ± 0 . 7 3△△組別 指標假手術組 A Q P 4（n = 1 0） G F A P模型組 A Q P 4

圖3 各組大鼠腦組織AQP4水平

圖4 各組腦組織GFAP水平WB測定結果

2.4 各組腦組織AQP4和GFAP表達比較 （1）免疫組化法。見圖1～2，表4。細胞核或胞質中存在棕黃色或棕褐色顆粒為AQP4和GFAP陽性細胞。與假陽性組相比，模型組大鼠腦損傷后12、24、48、72 h可見大量AQP4和GFAP陽性細胞，且染色較深；給藥組在腦損傷后12、24、48、72 h可見AQP4和GFAP陽性細胞，數量較模型組相應時間段減少，且顏色稍淺，而假手術組腦組織中僅可見少量散在的AQP4和GFAP陽性細胞。模型組各相應時間段AQP4和GFAP陽性細胞表達評分高于假手術組（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組各相應時間段腦組織中AQP4和GFAP陽性細胞數減少，陽性細胞表達IHC評分明顯低于模型組各相應時間段（P＜0.01）。（2）蛋白質免疫印跡法。見圖3～4，表5。假手術組僅見少量散在的AQP4和GFAP陽性細胞，與假手術組相比，模型組可見大量的AQP4和 GFAP陽性細胞表達，與模型組相比，給藥組AQP4和GFAP的陽性表達下降。與假手術組比較，模型組各時間段腦組織AQP4和GFAP表達量明顯增加 （P＜0.01），表明造模成功，給藥組各時間段腦組織AQP4和GFAP表達量下降，與模型組對應各時間段相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表5 各組創傷性腦損傷大鼠腦組織AQP4、GFAP表達水平比較（±s）

表5 各組創傷性腦損傷大鼠腦組織AQP4、GFAP表達水平比較（±s）

1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h 0 . 4 2 ± 0 . 0 5 0 . 4 3 ± 0 . 0 4 0 . 4 1 ± 0 . 0 6 0 . 4 2 ± 0 . 0 5 0 . 6 2 ± 0 . 0 3 0 . 6 3 ± 0 . 0 4 0 . 6 1 ± 0 . 0 3 0 . 6 2 ± 0 . 0 4 0 . 8 6 ± 0 . 0 8**1 . 4 3 ± 0 . 0 7**1 . 2 4 ± 0 . 0 8**1 . 0 6 ± 0 . 0 5**（n = 1 0） G F A P 1 . 0 2 ± 0 . 0 5**1 . 4 7 ± 0 . 0 6**1 . 2 9 ± 0 . 0 7**1 . 0 8 ± 0 . 0 5**給藥組 A Q P 4 0 . 6 3 ± 0 . 0 5△△1 . 1 4 ± 0 . 0 4△△0 . 9 6 ± 0 . 0 7△△0 . 7 1 ± 0 . 0 6△△（n = 1 0） G F A P 0 . 8 4 ± 0 . 0 4△△1 . 2 1 ± 0 . 0 3△△1 . 0 6 ± 0 . 0 4△△0 . 8 9 ± 0 . 0 7△△組別 指標假手術組 A Q P 4（n = 1 0） G F A P模型組 A Q P 4

3 討 論

中醫理論認為腦損傷的主要病機是腦髓損傷，清竅阻閉，其治療應以逐瘀通腑為原則，故泄下類中藥在腦損傷中的應用較多。大黃是泄下類中藥的代表藥物。腦損傷后繼發的腦水腫是臨床常見的危險因素，腦損傷后氧自由基急劇增加，誘發脂質過氧化反應，導致膜磷脂和蛋白質的氧化，可直接損傷神經細胞，加重損傷的程度，故自由基蓄積與二次損傷過程密切相關。大黃鞣質富含酚羥基，具有很強的供氫能力，能有效清除體內自由基。本研究表明大黃鞣質可提高體內SOD水平，抑制炎性因子的釋放，減輕腦水腫造成的二次損傷。大黃鞣質具有明顯的收斂作用，研究發現，大黃鞣質在腦損傷早期即可拮抗腦水腫，并且對腦水腫有長時間緩解作用；血管源性腦水腫是繼發性腦損傷的重要因素，本研究表明，大黃鞣質可降低損傷組織腦血管通透性，抑制腦水腫的程度，這可能是大黃鞣質對腦損傷保護作用的機制之一。

AQP4在神經系統廣泛表達，其含量與腦水腫的程度亦呈現正相關性［7］。腦損傷后神經元、星形膠質細胞膨脹，尤其是星形膠質細胞的膨脹，是導致腦水腫的直接原因［8］，研究證實AQP4與GFAP在損傷腦組織中共同存在［9］。本研究發現腦損傷后72 h內AQP4表達水平顯著上升，大黃鞣質給藥后可顯著降低其表達，表明大黃鞣質可減輕腦組織水腫程度。GFAP具有維持星形細胞形態和功能的作用，是星形膠質細胞的特異標志物，血清中濃度上升水平與創傷性腦損傷嚴重程度呈正相關［10］，本研究顯示大黃鞣質可以顯著降低腦損傷后GFAP蛋白表達水平，可緩解腦損傷后星形膠質細胞腫脹的程度。

本研究已表明大黃鞣質可提高SOD水平，降低大鼠損傷腦組織水含量、腦血管通透性及AQP4和GFAP的表達，從而對損傷腦組織起到較好的保護作用，大黃鞣質對腦損傷繼發的肺損傷、應激性高血糖的保護機制及其臨床應用效果有待進一步研究。

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Study of Rhubarb Tannins Effect on Acute Encephaledema by Rats with Encephaledema Followed by Traumatic Brain Injury

ZHANG Bo1，2，3，WANG Bing2，WANG Yongqiang2，et al.1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2 Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China；3 Tianjin Huanhu Hospital，Tianjin 300060，China

Objective：To observe the influence of Rhubarb tannins on encephaledema followed by traumatic brain injury in SD rats.Methods：In order to prepare of traumatic brain injury model，the classic Feeney free fall drop was used to wounded rats.Rhubarb tannins were given rats by intraperitoneal injection.The brain of rat water content，cerebral vascular permeability，SOD level，cell AQP4 and GFAP expression using immune histochemical method and protein determination of western blot test were determination.Results：The brain of rat water content and the cerebral vascular permeability in the Rhubarb tannins group were significantly lower than those in the model group（P＜0.05）.The SOD level in Rhubarb tannins group was higher obviously than that in the model group（P＜0.05）.The AQP4 and the GFAP in Rhubarb tannins group were decreased remarkably.There were some statistical differences between the Rhubarb tannins group and the model group（P＜0.05）.Conclusion：Rhubarb tannins can cure encephaledema in rats followed by traumatic brain injury.Its mechanism is through reduction of cell AQP4 and GFAP expression，decrease of cerebral vascular permeability and increase of SOD level to achieve protective effect of encephaledema.

Rhubarb tannins；Brain injury；Encephaledema；Inhibition

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0380-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.002

2014-12-13）

衛生部國家臨床重點專科建設項目

△通信作者（電子郵箱：zhangbdr@126.com）