一種簡(jiǎn)單的溶栓用大鼠急性大腦中動(dòng)脈栓塞模型的改進(jìn)*

賈 翔黃 燕孫景波

（1.廣東省廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

·研究報(bào)告·

一種簡(jiǎn)單的溶栓用大鼠急性大腦中動(dòng)脈栓塞模型的改進(jìn)*

賈 翔1黃 燕2孫景波2

（1.廣東省廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

目的探索一種簡(jiǎn)單實(shí)用的溶栓用大鼠急性大腦中動(dòng)脈栓塞模型制作方法。方法用留置針將大鼠自體血栓從頸動(dòng)脈打到大腦中動(dòng)脈處，可造成急性大腦中動(dòng)脈栓塞模型。結(jié)果模型組成功率高，死亡率低，且造成的腦梗死體積與目前公認(rèn)的造模方法基本相同。結(jié)論該模型穩(wěn)定可靠，成功率高，大大降低了手術(shù)難度，節(jié)約了研究時(shí)間及成本，更適用于評(píng)價(jià)溶栓治療效果的實(shí)驗(yàn)研究。

溶栓 大腦中動(dòng)脈栓塞模型 簡(jiǎn)便實(shí)用

急性缺血性卒中的溶栓治療從上世紀(jì)90年代開始，經(jīng)過10余年的多國(guó)家多中心研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，但仍是國(guó)際上討論的重點(diǎn)問題。建立完善的動(dòng)物模型對(duì)研究腦梗死的發(fā)病機(jī)制、病理生理及溶栓療效都非常的重要。當(dāng)前成熟的建立局灶性腦缺血模型的方法如線栓法、電凝法、光化學(xué)法、開顱結(jié)扎法、內(nèi)皮素注射法等均能不同程度地反映腦梗死的病理生理變化，但作為溶栓治療血栓栓塞性腦梗死的模型則不適宜。筆者于研究當(dāng)中，在前人基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，形成了一種操作簡(jiǎn)便、成功率高、重復(fù)性好的大鼠急性大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型制作方法，更適用于急性缺血性腦血管病治療及溶栓藥物的評(píng)價(jià)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 1）動(dòng)物：健康成年SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0089437。隨機(jī)分為假手術(shù)組10只，模型組30只。2）主要器材與試劑：核磁共振掃描儀（GE HD3.0T），PSMB雙目動(dòng)物手術(shù)顯微鏡（物鏡F200），24 G靜脈留置針，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液，凝血酶。

1.2 模型制作 見圖1。大鼠以10%水合氯醛按0.35 mL/100 g體質(zhì)量腹腔麻醉，仰臥固定，頸部正中位備皮，消毒，鋪巾。取頸正中皮膚切口，鈍性分離肌肉及皮下組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），分離迷走神經(jīng)（切忌鉗夾），將CCA鈍性分離至暴露頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）分叉處。用1 mL注射器選大鼠易結(jié)扎止血的動(dòng)脈（如股動(dòng)脈）處取動(dòng)脈血0.1 mL，吸入4 U凝血酶，混勻靜置10 min，待血液凝固后將其注入24 G靜脈留置針管，制成長(zhǎng)約1 cm的栓子，后接1～2 mL的0.9%氯化鈉注射液注射器。制作過程中注意勿使留置針管內(nèi)進(jìn)入空氣。將留置針在ECA和ICA分叉的前方穿刺進(jìn)CCA，并向前內(nèi)側(cè)進(jìn)入ICA內(nèi)10 mm，拔出針芯，用吸有0.9%氯化鈉注射液的注射器快速將栓子沖入ICA內(nèi) （強(qiáng)大推力足以使栓子沖到MCA起始部），結(jié)扎CCA并縫合肌肉及皮膚。假手術(shù)組手術(shù)操作與模型組相同，注入0.9%氯化鈉注射液代替栓子。

圖1

1.3 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分及MR掃描 大鼠清醒后對(duì)其進(jìn)行提尾懸空實(shí)驗(yàn)，神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分采用Bedersen法［1］。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損。1分：對(duì)側(cè)前肢屈曲。2分：拉尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢抓力下降。3分：向各方自發(fā)運(yùn)動(dòng)，拉尾時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)。4分：向?qū)?cè)自發(fā)旋轉(zhuǎn)。取模型組大鼠1只進(jìn)行MR掃描，觀察是否有梗死灶。

1.4 腦梗死體積（率）測(cè)定 大鼠造模3 h處死，將腦組織置入-20℃冰箱內(nèi)速凍20 min后，制備2 mm厚的冠狀腦片，浸入2%TTC溶液中，37℃避光水浴30 min，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，拍照后用圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）測(cè)定梗死體積。梗死體積=非缺血側(cè)半球體積－缺血側(cè)半球未梗死區(qū)體積，梗死灶體積率的計(jì)算以梗死灶體積和非缺血側(cè)半球體積的百分比（%）來表示［2］。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠死亡率比較 模型組有2只大鼠在造模后3 h內(nèi)死亡，死亡率為6.67%。死亡大鼠腦組織TTC染色發(fā)現(xiàn)手術(shù)同側(cè)大面積腦梗死，甚至對(duì)側(cè)也出現(xiàn)梗死。假手術(shù)組無動(dòng)物死亡。

2.2 兩組大鼠行為學(xué)觀察指標(biāo)比較 模型組28只存活大鼠提尾懸空實(shí)驗(yàn)均呈陽性（大鼠提尾懸空1 m，梗死灶對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收屈曲）且梗死灶側(cè)眼部Horner征；術(shù)后神經(jīng)功能缺損評(píng)分：0分0例，1分2例（7.1%），2分 6例 （21.4%），3分 11例 （39.3%）。4分 9例（32.1%）。假手術(shù)組大鼠無任何行為學(xué)改變。

表1 兩組大鼠造模神經(jīng)功能評(píng)分比較（n）

2.3 MR掃描 見圖2。模型組MR掃描可見明顯梗死灶。

圖2 模型組MR掃描

2.4 兩組大鼠腦梗死體積率比較 見圖3。造模后3h測(cè)定模型組腦梗死體積為（264.85±33.43）mm3，腦梗死體積率為 （40.76±4.68）%。假手術(shù)組大鼠腦組織TTC染色無變化。

圖3 梗死后腦組織TTC染色

3 討 論

用于溶栓治療研究的急性腦梗死的動(dòng)物模型與其他類型的腦梗死模型不同，要求腦梗死必須是由血栓阻塞腦動(dòng)脈所致，所以普通局灶性腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型制作方法如線栓法、電凝法、光化學(xué)法、內(nèi)皮素注射法等不可用來做溶栓治療的實(shí)驗(yàn)。目前溶栓用動(dòng)物模型常參照Zhang等［3］的改良栓塞法及張新江等［4］的栓子制作方法，但是以筆者在模型復(fù)制過程中的體會(huì)，栓子制備過程長(zhǎng)，制作方法復(fù)雜，所需器材、試劑繁多，手術(shù)操作過程繁瑣不易控制，且大鼠死亡率高。故筆者在前人的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，形成了上述操作簡(jiǎn)便、成功率高、重復(fù)性好的急性MCAO模型制作方法。

該模型較以往有以下優(yōu)點(diǎn)：1）手術(shù)創(chuàng)傷小，不必分離結(jié)扎ECA及ICA的顱外分支翼腭動(dòng)脈（PPA）以減少手術(shù)難度，節(jié)約手術(shù)時(shí)間。以往需要分離ECA并從ECA逆行插管至ICA，對(duì)導(dǎo)管的柔韌度有較高要求且不易操控導(dǎo)管走行，此外因?qū)Ч軆?nèi)徑細(xì)，容易誤入PPA內(nèi)導(dǎo)致模型失敗，所以還要結(jié)扎PPA。根據(jù)劉亢丁等［5］的鑄型標(biāo)本測(cè)量，PPA在ICA起始2～3 mm后向前外側(cè)發(fā)出，ICA起始距MCA起始距離為13～14 mm，ICA起始部?jī)?nèi)徑為（0.3±0.03）mm。筆者用24 G靜脈留置針（內(nèi)徑0.7 mm）從CCA穿刺進(jìn)入ICA后沿前內(nèi)側(cè)進(jìn)入10 mm（如果插入順暢，則說明避過了PPA），用強(qiáng)大推力足以使栓子沖到MCA起始部。2）栓子制備過程簡(jiǎn)單，整個(gè)栓塞過程簡(jiǎn)化，可操作性強(qiáng)。以往栓子制作過程十分繁復(fù)，筆者直接在動(dòng)脈血內(nèi)加入凝血酶促凝制栓，同樣類似于人類的自然梗死現(xiàn)象。3）該方法產(chǎn)生顯著而持久的供血中斷，并形成了范圍恒定和邊界清楚的梗死灶，在確定血栓注射入ICA后，造模成功率幾達(dá)100%。4）造模過程需用器材及試劑較以往更少更易獲取，降低了研究成本。5）如果注入感染的栓子還可進(jìn)行腦膿腫的研究。

該方法的缺點(diǎn)是除了MCA梗死外，偶爾會(huì)出現(xiàn)大腦前動(dòng)脈和大腦后動(dòng)脈的小面積梗死，甚至有對(duì)側(cè)梗死。若進(jìn)行對(duì)MCA部位梗死不過分要求的溶栓或局灶性腦缺血藥物保護(hù)機(jī)制的研究，筆者認(rèn)為此簡(jiǎn)單易行的血栓栓塞模型仍不失為首選。

［1］ Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472-476.

［2］ 黃如訓(xùn)，譚盛.一種適用于溶栓的腦梗死模型［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，18（2）：150-151.

［3］ Zhang RL，Chopp M，Zhang ZG，et al.A rat model of focal embolic cerebral ischemia［J］.Brain Res，1997，766（1-2）：83-92.

［4］ 張新江，常麗英，張?zhí)K明，等.大鼠自體血栓大腦中動(dòng)脈閉塞模型的改良［J］.卒中與神經(jīng)疾病，2003，10（1）：12-15.

［5］ 劉亢丁，蘇志強(qiáng)，李毅平，等.實(shí)驗(yàn)性局灶性腦缺血再灌注動(dòng)物模型的改進(jìn)及評(píng)價(jià)［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，1997，14（2）：87-89.

A Simple Method to Improve the Rat Model of Acute Middle Cerebral Artery Embolic Stroke Used in Thrombolysis

JIA Xiang，HUANG Yan，SUN Jingbo. Guangzhou Hospital of Chinese Traditional and Western Medicine，Guangdong，Guangzhou 510800，China

Objective：To explore a convenient and practical MCA embolic model for thrombolysis.Methods：The MCA embolic model was established by using the autologous blood clots in rat from the carotid artery to middle cerebral artery with a retention needles.Results：The model group had a high success rate and low mortality，and the infarction volume fitted in the accepted method.Conclusion：The model is stable，reliable with a high success rate，greatly reducing the difficulty in operation，saving time and research cost，which may be useful in evaluating the safety and efficacy of thrombolytic therapies.

Thrombolysis；MCA embolic model；Convenient and practical

R285.5

A

1004-745X（2015）06-0943-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.002

2015-03-08）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81072783）；廣東省財(cái)政廳專項(xiàng)經(jīng)費(fèi) “中醫(yī)藥干預(yù)中風(fēng)病有效靶點(diǎn)與作用環(huán)節(jié)研究”項(xiàng)目（粵財(cái)社【2010】5號(hào)）