丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠外周血CD4+T細胞調節的作用研究*

彭 戩程 光馬 軍王南下

（1.湖北省武漢市東湖醫院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學附屬協和醫院，湖北 武漢430030）

·研究報告·

丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠外周血CD4+T細胞調節的作用研究*

彭 戩1程 光2馬 軍2王南下2

（1.湖北省武漢市東湖醫院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學附屬協和醫院，湖北 武漢430030）

目的探討丹參酮Ⅱ A對膿毒癥大鼠外周血CD4+T細胞的作用。方法采用盲腸結扎穿孔術制備膿毒癥大鼠模型（CLP），給予丹參酮Ⅱ A（Tan Ⅱ A）處理，分別于治療前及治療后24、48、72 h各時間點取靜脈血，流式細胞儀檢測全血細胞中輔助性T細胞（Th1、Th2、Th17）；采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血中白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-17（IL-17）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。結果CLP組大鼠血清TNF-α、IL-17、IL-1水平和Th17比例明顯高于同期Sham組（P＜0.05），而TanⅡA各亞組血清TNF-α、IL-17、IL-1水平和Th17比例均低于CLP同期各亞組（P＜0.05）；CLP組大鼠血清IL-10水平和Th1/ Th2比值明顯低于Sham組（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清IL-10水平和Th1/Th2比值高于CLP同期各亞組（P＜0.05）。結論丹參酮Ⅱ A可能通過作用于膿毒癥大鼠的外周血CD4+T細胞發揮調節免疫、改善炎癥反應的作用。

丹參酮Ⅱ A 膿毒癥 CD4+T細胞

膿毒癥是由感染因素誘發的一種全身性的炎癥反應，并不是一種獨立疾病，而是包括免疫系統在內的多系統共同作用的結果。促癥/抗炎失衡以及免疫功能紊亂是膿毒癥發生及發展的中心環節。因此早期控制、清除炎癥因子是膿毒癥的治療關鍵［1-2］。丹參酮ⅡA（TanⅡA）是中藥丹參的有效成分之一，具有抗炎、調節免疫功能的作用［3］，但其在膿毒癥抗炎、調節免疫的臨床應用及機理研究較少。因此，本研究觀察了丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠促癥/抗炎失衡以及免疫功能紊亂的保護作用，為臨床應用提供實驗依據?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 72只SPF級雄性Sprague Dawley大鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司），體質量260~ 320 g，動物許可證號：2008-0001。

1.2 試藥與儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液 （規格2 mL∶10 mg，上海第一生化藥業有限公司生產，國藥準字H31022558）。Elisa試劑盒測試盒購自武漢博士德生物工程有限公司。熒光標記的單抗購自Coalter公司，FACSCalibur流式細胞儀和Simul SET軟件購自美國BD公司。其余試劑為國產分析純（武漢康盛醫藥科技有限公司）。

1.3 分組與給藥 將大鼠隨機分成3組：盲腸結扎穿孔手術（CLP）、Tan Ⅱ A組和假手術組（Sham），每組24只，每組又再分為24、48、72 h 3個亞組，每組8只；Tan Ⅱ A組和CLP組行盲腸結扎穿孔手術，Sham組僅做盲腸探查術；Tan Ⅱ A組于術后腹腔注射20 mg/d的丹參酮Ⅱ A磺酸鈉注射液 （Tan Ⅱ A），Sham組和CLP組分別于術后腹腔注射等量生理鹽水，所有藥物處理連續72 h，均提供相同環境和飲食。

1.4 模型制備 采取盲腸結扎穿孔手術（CLP）。模型大鼠術前禁食12 h，給予10%水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔注射進行麻醉，麻醉充分后置于仰臥位，消毒腹部皮膚后于中下腹部行3 cm縱行切口打開腹腔，尋找并充分暴露出盲腸，采用3號縫合線于距盲腸末端1cm處行環形結扎，盲腸僅結扎50%以保證腸道通暢，并據結扎處3~5 mm處采用9號針頭貫穿盲腸3次，穿刺后手工擠壓出部分腸內容物溢出于腹腔，并進行關腹手術。

1.5 標本采集與檢測 1）IL-1、IL-10、IL-17和TNF-α測定。干預前和干預后24、48、72 h分別采集靜脈血，低溫高速離心處理（3000 r/min離心15 min），取上清。采用Elisa法檢測血清中的IL-1、IL-10、IL-17和TNF-α炎性因子水平，所有操作均嚴格按照試劑盒的說明進行。2）流式細胞儀檢測CD4+T細胞。采用直接免疫熒光標記全血溶血法流式細胞儀測定外周血Th1、Th2、Th17細胞。

1.6 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組血清TNF-α、IL-10、IL-1測定結果比較 見表1。CLP組大鼠血清TNF-α和IL-1水平明顯高于同期Sham組（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清TNF-α和IL-1水平低于CLP同期各亞組 （P＜0.05）；CLP組大鼠血清IL-10水平明顯低于Sham組 （P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清IL-10水平高于CLP同期各亞組（P＜0.05）。

2.2 各組血清IL-17、Th17、Th1/Th2測定結果比較見表2。CLP組大鼠血清IL-17水平和Th17比例明顯高于同期Sham組（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清IL-17水平和Th17比例低于CLP同期各亞組 （P＜0.05）；CLP組大鼠血清Th1/Th2比值明顯低于Sham組（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清Th1/Th2比值高于CLP同期各亞組（P＜0.05）。

表1 各組血清TNF-α、IL-10、IL-1測定結果比較（pg/mL，±s）

表1 各組血清TNF-α、IL-10、IL-1測定結果比較（pg/mL，±s）

與Sham組比較，*P＜0.05；與CLP組比較，△P＜0.05。下同。

組別時間 T N F -α S h a m組 2 4 h 2 9 . 7 ± 1 . 4（n = 8） 4 8 h 2 7 . 1 ± 1 . 3 7 2 h 2 8 . 3 ± 1 . 1 I L -1 I L -1 0 1 4 . 3 ± 1 . 5 2 3 1 . 9 ± 7 . 5 1 4 . 1 ± 1 . 2 2 2 9 . 1 ± 8 . 2 1 4 . 4 ± 1 . 0 2 3 4 . 9 ± 8 . 5 C L P組 2 4 h 2 6 5 . 6 ± 9 . 5*2 7 . 7 ± 4 . 2*1 4 5 . 1 ± 3 . 5*（n = 8） 4 8 h 3 6 . 7 ± 4 . 4*1 2 2 . 3 ± 3 . 8*3 5 9 . 8 ± 8 . 7*7 2 h 4 3 . 4 ± 3 . 2*1 0 1 . 5 ± 2 . 7*4 5 9 . 7 ± 8 . 4*T a nⅡ A組 2 4 h 1 8 . 8 ± 1 . 4*△1 8 5 . 4 ± 2 . 4*△2 1 6 . 6 ± 5 . 3*△（n = 8） 4 8 h 2 0 . 1 ± 1 . 1*△1 5 5 . 8 ± 3 . 2*△2 7 6 . 4 ± 5 . 1*△7 2 h 2 5 . 4 ± 1 . 3*△1 3 4 . 4 ± 3 . 9*△3 1 7 . 6 ± 5 . 2*△

表2 各組血清IL-17、Th17、Th1/Th2測定結果比較（±s）

表2 各組血清IL-17、Th17、Th1/Th2測定結果比較（±s）

組別 時間 T h 1 / T h 2 S h a m組 2 4 h 1 7 . 8 ± 2 . 5（n = 8） 4 8 h 1 7 . 5 ± 2 . 3 7 2 h 1 8 . 1 ± 3 . 1 I L -1 7（p g / m L） T h 1 7（%）7 . 5 ± 1 . 3 2 . 2 ± 0 . 2 7 . 8 ± 1 . 2 2 . 2 ± 0 . 2 7 . 4 ± 1 . 4 2 . 1 ± 0 . 1 C L P組 2 4 h 7 . 6 ± 1 . 1*7 7 . 7 ± 7 . 2*2 . 8 ± 0 . 2*（n = 8） 4 8 h 9 6 . 7 ± 8 . 5*3 . 7 ± 0 . 1*5 . 4 ± 0 . 7*7 2 h 1 1 5 . 4 ± 7 . 4*4 . 8 ± 0 . 2*2 . 1 ± 0 . 1*T a nⅡA組 2 4 h 4 2 . 3 ± 4 . 7*△2 . 5 ± 0 . 1*△1 4 . 3 ± 2 . 3*△（n = 8） 4 8 h 5 6 . 2 ± 5 . 0*△2 . 8 ± 0 . 2*△1 0 . 1 ± 1 . 5*△7 2 h 7 7 . 3 ± 7 . 7*△3 . 0 ± 0 . 3*△8 . 2 ± 1 . 0*△

3 討 論

膿毒癥是由感染因素誘發的全身炎癥反應，是機體免疫、炎癥系統在內的多系統共同作用的結果，已成為重癥患者最主要的死亡原因之一［4］，而到目前為止，關于膿毒癥的治療還沒有取得突破性的進展。經典治療的失敗使人們認識到免疫水平的調節可能成為膿毒癥治療的突破，但目前無論是指導治療的免疫學指標還是糾正免疫紊亂的手段都還處于起步階段［5］。丹參酮ⅡA是中藥丹參的有效成分之一，研究已經發現其具有抗炎、調節免疫功能的作用，但其在膿毒癥的臨床應用方面報道較少［3］。

TNF-α是炎性遞質網絡通路中的關鍵因子，其增加可導致炎癥遞質失控性釋放，IL-1能增加TNF-α的促炎作用，而IL-10是重要的免疫負調節因子和抗炎遞質，能減少TNF-α的促炎作用［6］。筆者通過對炎性遞質網絡通路中的關鍵因子TNF-α、IL-1及IL-10在膿毒癥時的變化進行了觀察，發現CLP同期TNF-α和IL-1水平較對照組同期明顯升高，IL-10水平有明顯降低；給予Tan Ⅱ A處理的后，各亞組同期TNF-α和IL-1水平有明顯降低，而IL-10水平有明顯上升；證實了Tan Ⅱ A的抗炎作用。

CD4+T細胞是參與機體免疫反應的重要細胞之一，其亞群Th1、Th2細胞與Th17細胞分泌的各種細胞因子在機體促炎、抗炎中發揮著重要作用［7-8］。其中Th1細胞參與細胞免疫，介導細胞和局部炎癥的免疫應答，而Th2細胞可刺激B細胞分泌抗體參與體液免疫，Th1/Th2的失衡可導致免疫抑制［9］；研究發現MODS過程中可出現Th1/Th2比值下降，表現為Th1細胞減少，而Th2細胞增加［10］；本研究發現膿毒癥可導致Th1/Th2比值下降，提示機體免疫功能紊亂，而給予Tan Ⅱ A處理后其血清Th1/Th2比值高于膿毒癥組同期各亞組，說明Tan Ⅱ A對膿毒癥時Th1/Th2的失衡有改善作用，提示其能改善膿毒癥時的機體免疫功能紊亂；Th17細胞可通過分泌IL-17誘導多種促炎性細胞因子和趨化因子，參與機體炎性反應［11-12］，發揮重要免疫調節作用，是一種重要的促炎性細胞；本研究中CLP組大鼠血清IL-17水平和Th17比例明顯高于同期Sham組，而給予Tan Ⅱ A處理的各亞組中，其血清IL-17水平和Th17比例較CLP同期各亞組有顯著下降，提示丹參酮Ⅱ A可通過降低膿毒癥Th17細胞數量，減少血清IL-17含量來緩解其介導的促炎反應。

綜上所述，隨著人們對膿毒癥病理生理改變和致病機制不斷深入地認識，免疫功能的調理在膿毒癥治療中的重要性已經得到重視，本研究證實丹參酮Ⅱ A能通過調節Th1、Th2以及Th17細胞和IL-17抑制膿毒癥大鼠炎癥的發展。

［1］ Li J，Carr B，Goyal M，et al.Sepsis：the inflammatory foundation of pathophysiology and therapy［J］.Hosp Pract（Minneap），2011，39（3）：99-112.

［2］ Carney DE，Matsushima K，Frankel HL.Treatment of sepsis in the surgical intensive care unit［J］.Isr Med Assoc J，2011，13（11）：694-699.

［3］ 徐赤裔，金雨虹，張可靜，等.丹參抗急性肺損傷及其機制的研究［J］.浙江醫學，2012，34（10）：780-782.

［4］ Vincent JL，H K.Epidem iology of severe sepsis in the intensive care unit［J］.BrJHosp Med（Lond），2008，69（8）：442-443.

［5］ Lewis DH，Chan DL，Pinheiro D，et al.The immunopathology of sepsis：pathogrn recognition，systemic inflammation，the compensatory anti-inflammatory response，and regulatory T cells［J］.JVet Intern Med，2012，26（3）：457-482.

［6］ Bhargava R，Altmann CJ，Andres-Hernando A，et a1．Acute lung injury and acute kidney injury are established by four hours in experimental sepsis and are improved with pre，but not post，sepsis administration of TNF-α antibodies［J］.PLoS One，2013，8（11）：e79037.

［7］ 張麗娜，吳鐵軍，張保軍，等.嚴重多發傷患者Th17細胞的變化特點及其與繼發膿毒癥的關系 ［J］.中國急救醫學，2012，32（6）：502-505.

［8］ 程紀群，唐朝暉，白祥軍.嚴重多發創傷患者傷后調節性T細胞的變化及其與損傷嚴重和膿毒癥的關系［J］.中華創傷雜志，2009，25（7）：452-455.

［9］ Peng Y，Chen Z，Yu W.Effects of thymic polypeptides on the thymopoiesis of mouse embryonic stern cells［J］.Cell Biol Int，2008，32（10）：1265-1271.

［10］Janssens JP，Roux-Lombard P，Pemeger T，et al.Contribution of a IFN-gamma assay in contact tracing for tuberculosis in a Low-incidence，high immigration area［J］.Swiss Med Wkly，2008，138（39-40）：585-593.

［11］Littman DR，Rudensky AY．Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation［J］．Cell，2010，140（6）：845-858．

［12］Hirota K，Duarte JH，Veldhoen M，et a1．Fate mapping of IL-17 producing T cells in inflammatory responses［J］．Nat lmmunol，2011，12（3）：255-263.

Effect of Tanshinone Ⅱ A on Peripheral Blood CD4+T Cells in Rats with Sepsis

PENG Jian，CHENG Guang，MA Jun，et al.Wuhan Donghu Hospital in Hubei Province，Hubei，Wuhan 430074，China

Objective:To explore the effect of Tanshinone Ⅱ A on the peripheral blood CD4+T cells in rats with sepsis.Methods:The sepsis rat model was established by cecal ligation and puncture operation（CLP），and the Tanshinone Ⅱ A（Tan Ⅱ A）was given for consecutive hours.the level of Th1、Th2 and Th17 were assessed by FACS flow cytometer，Enzyme linked immunoadsordent assay（ELISA）was used to determine the levels of serum interleukin-1（IL-1）、interleukin-10（IL-10）、interleukin-17（IL-17）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）were measured before and at 24，48，72 h after the treatment with Tan Ⅱ A.Results:The level of serum TNF-α、IL-17、IL-1 and Th17 ratios in each subgroup of CLP were significantly higher than that of the same period in each subgroup of Sham（P＜0.05）；and serum TNF-α，IL-17，IL-1 levels and Th17 ratio in each subgroup of Tan Ⅱ A were lower than that of the same period in each subgroup of CLP，the difference was statistically significant（P＜0.05）；The serum IL-10 level and the ratio of Th1/Th2 in each subgroup of CLP were lower than that of the same period in each subgroup of Sham（P＜0.05）；and the level of serum IL-10 and the ratio of Th1/Th2 in each subgroup of Tan Ⅱ A were higher than that of the same period in each subgroup of CLP，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion:Tanshinone Ⅱ A shows a protective effect on the immune inflammatory reaction in septic rats may be through the regulation of the peripheral blood CD4+T cells.

Tanshinone Ⅱ A；sepsis；peripheral blood CD4+T cells

R285.5

A

1004-745X（2015）06-0946-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.003

2015-02-26）

國家自然科學基金（30500657）；湖北省自然科學基金（2011CDB196）