無柄小葉榕耐寒性研究

張曉勉，高智慧，李明良，岳春雷，

袁信昌4，吳敏霞5，王 泳1，李賀鵬1，陳 斌4

（1. 浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省林業技術推廣總站，浙江 杭州 310020；3. 浙江省桐廬縣莪山鄉人民政府，浙江 桐廬 311512；4. 浙江省舟山市農林與漁農村委員會，浙江 舟山316021；5. 浙江省溫嶺市林業技術推廣站，浙江 溫嶺 317500）

無柄小葉榕耐寒性研究

張曉勉1，高智慧2*，李明良3，岳春雷1，

袁信昌4，吳敏霞5，王 泳1，李賀鵬1，陳 斌4

（1. 浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省林業技術推廣總站，浙江 杭州 310020；
3. 浙江省桐廬縣莪山鄉人民政府，浙江 桐廬 311512；4. 浙江省舟山市農林與漁農村委員會，浙江 舟山316021；5. 浙江省溫嶺市林業技術推廣站，浙江 溫嶺 317500）

采用人工模擬低溫處理技術測定無柄小葉榕離體葉片在不同低溫梯度脅迫下電解質滲出率的變化，并利用Logistic方程擬合其電解質滲出率的曲線，計算半致死溫度（LT50）。結果表明：在低溫脅迫處理過程中，隨著溫度的降低，電解質滲出率與處理溫度呈負相關；電解質滲出率整體變化呈典型的“S”形單峰曲線；經顯著性檢驗相關系數均在0.91以上，符合Logistic方程；通過方程拐點確定無柄小葉榕半致死溫度為-3.95℃。

無柄小葉榕；電解質滲出率；電導法；Logistic方程；耐寒性

無柄小葉榕（Ficus concinna var. subsessilis）是小葉榕（Ficus concinna）的一個變種，在我國主要分布在浙江南部、廣西、廣東等省份[1~2]。無柄小葉榕樹姿雄偉，長壽常綠，是優良的造林綠化樹種；同時由于其優良的耐鹽堿特征使其成為一種沿海防護林建設的重要樹種，在我國南方的生態綠化中占據重要的位置[3]。但由于該樹種主要產于我國亞熱帶最北緣，對于干旱和低溫相對敏感，因此探討和研究無柄小葉榕的耐寒特性和寒害發生機理對于擴大其種植面積和制定合理的抗寒措施有重要意義。

電導法結合Logistic方程判斷電解質外滲與低溫傷害程度的關系是測定植物耐寒性常用的方法[4]。從Dexter等使用電導法測定植物抗性以來[4]，這種方法得到了不斷的完善和發展。Sukumatan等提出了電解質透出率達50%時為半致死溫度的觀點[5]，但半致死溫度并不總是表現為電解質透出率達50%時的溫度。Rajashekar C等利用Logistic曲線描述低溫對植物細胞膜的傷害過程，提出曲線拐點為LT50的觀點[6]，即以植物組織在一系列冰凍溫度下測得的電解質透出率配以 Logistic方程，利用求拐點溫度作為組織半致死溫度。半致死溫度在溫度——細胞傷害率的“S”型曲線上表現為曲線的拐點所對應的溫度，它能較直觀、準確地反映植物的抗寒能力和所能耐受的低溫極限，這種觀點在我國得到了廣泛的認同[7~11]。

本研究根據低溫脅迫后細胞原生質滲透性發生變化這一原理，應用電導法結合 Logistic方程擬合求出無柄小葉榕半致死溫度，從而對其耐寒性能進行初步評價分析，為其在浙江擴大栽培區域以及制定合理的抗寒措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗時間為2013年3月，實驗材料來自浙江省林業科學研究院大棚中栽培的3年生小葉榕盆栽苗。實驗時從盆栽苗中隨機選取生長基本一致的葉片樣品帶回實驗室進行相應實驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 低溫處理 取各單株成熟葉片進行低溫處理．隨機采取各單株位于中上部當年生側枝上的第4、第5、第6個葉片（完整無病蟲害），每個單株15枚左右。采后用濕潤紗布包裹放入自封袋中密封，帶回實驗室，用自來水、蒸餾水和重蒸餾水沖洗干凈后，用紗布擦干，各單株葉片分為3個重復（每重復5片），低溫處理設為0、-2、-4、-6、-8℃ 5個溫度梯度，低溫處理時降溫幅度為4℃/h，達到處理溫度后保持24h，然后解凍（升溫速度為4℃／h），解凍溫度達室溫（15℃）后，進行葉片受害程度觀測和電導率測定。

1.2.2 電解質滲出率（相對電導率）的測定 低溫處理結束后，取出試管，加入蒸餾水5 mL，真空滲入15 min，振蕩一下，置25℃下放置3 h，取出再振蕩一下，靜置后用DDS-11A型數字電導率儀測電導率值，后置沸水浴中15 min，冷卻后測煮沸電導率值，計算電解質滲出率（相對電導率，處理電導率與煮沸電導率之百分比）。1.2.3 數據處理 對實驗數據（電解質滲出率）進行Logistic回歸分析，Logistic方程為：

其中，y為實測細胞傷害率；t代表冷凍溫度；k為細胞傷害率的飽和容量；a、b為方程參數。為確定a、b值，將Logistic方程轉化為，則轉化為細胞傷害率（ y'）與處理溫度（t）的直線方程。通過直線回歸的方法求出a、b值，對回歸方程進行二階導數變換的方程曲線的拐點值，即為半致死溫度（LT50）。

2 結果與分析

2.1 不同低溫處理對無柄小葉榕形態變化的影響

不同低溫處理后小葉榕葉片樣品于室內靜置12 h后，觀察其形態變化，結果見表1。從表1可以看出，不同低溫處理條件下小葉榕葉片受傷害程度差異比較明顯。總體表現為：0和-2℃處理后，凍害不明顯；-4℃處理后產生凍害；-6℃處理后有明顯凍害；-8℃處理后有嚴重凍害。

2.2 不同低溫處理對無柄小葉榕葉片電解質滲出率的影響

表1 葉片凍害程度形態觀察Table 1 Morphological changes after different cold stress

低溫造成膜傷害的結果是膜滲透性的改變和喪失，細胞內物質大量向外滲透，并最終引起細胞的死亡。電解質滲出率可以反映組織傷害的程度和植物抗寒能力的高低[8]。

從圖1可以看出，整個電解質滲出率的變化趨勢呈緩慢、急劇、再緩慢的“S”型變化趨勢，處理溫度與電解質滲出率之間呈顯著負相關，平均相關系數達-0.932。有研究表明，低溫使膜透性呈可逆性增加時，是葉片細胞對低溫刺激的一種適應性反應；當它呈半可逆增加時，則是細胞遭受傷害的標志；呈不可逆增加時，則是細胞因冷致死的結果[13]。

從整個低溫處理過程來看，在 0℃時，電解質滲出率平均值為26%，說明細胞膜已有部分破壞。從0℃到-2℃過程中，電解質滲出率降低，原因可解釋為在剛開始一段時間內植物細胞膜受到一定程度的破壞，而后由于植物對低溫脅迫產生了一定的防衛反應，特別是保護酶系統和滲透調節等適應性防御反應在一定程度上維持膜結構的穩定性，使電解質滲出率有所降低。但當溫度在-2℃到-6℃過程中，隨著溫度的繼續降低，低溫脅迫超出了植物細胞的防衛反應能力，使植物細胞膜破壞加強，導致細胞電解質滲出率急劇上升[14]。當溫度低于-6℃時，細胞電解質滲出率增速變緩，說明膜透性幾乎完全被破壞[15]。

圖1 不同溫度梯度小葉榕葉片電解質滲出率Figure 1 Electrolyte leakage rate in leaves of F. concinna var. subsessilistreated with different temperature

2.3 低溫處理條件下無柄小葉榕電解質滲出率Logistic回歸模型建立及抗寒性能分析

半致死溫度是植物抗寒性強弱的重要參考指標，某植物的半致死溫度只有低于或等于該地區的最低溫度時，該植物才能正常越冬。因此，對植物組織進行人工低溫處理，通過分析不同溫度下的電解質滲出率值，模擬出相應的 Logistic回歸方程，能較好地反映出該植物的抗寒能力[16]。朱根海等在研究不同低溫處理盆栽小麥的變化情況時發現，其電解質滲出率曲線呈“S”形，認為應用電導法配合 Logistic方程求出“S”形曲線的拐點溫度能較準確地估計出植物組織的低溫半致死溫度（LT50），而且LT50可作為植物抗寒性的重要指標之一[9]。Logistic方程是一個典型的“S”曲線方程，在數學上拐點即時的值，即為LT50。莫惠棟利用方程回歸統計法對溫度和電解質滲出率進行Logistic回歸分析，計算出LT50，并進行擬合度檢驗，認為可以很好的估計出植物組織的低溫半致死溫度[17]。

本研究以0、-2、-4、-6、-8℃人工低溫處理條件下，各無柄小葉榕離體葉片的電導率數值為依據 ，建立無柄小葉榕葉片電解質滲出率的回歸方程（表 2）。從表 2可以看出，在低溫脅迫下，電解質滲出率與溫度之間的關系曲線，能較好地用Logistic曲線方程進行擬合，擬合度都在0.91以上，達到顯著水平。說明在本研究中，不同低溫處理的電解質滲出率遵循 Logistic方程的變化規律，與半致死溫度呈線性關系，且擬合結果可靠，精確度較高。通過對三個重復得到的半致死溫度的平均可以得出無柄小葉榕低溫的LT50為-3.95℃。將各重復半致死溫度代入擬合方程可得出拐點溫度時細胞傷害率，經過計算三個重復細胞傷害率的平均值為50%。

表2 不同低溫下無柄小葉榕電解質滲出率擬合Logistic方程及LT50Table 2 Fitted logistic equation and half lethal temperature(LT50) for electrolyte leakage rate in leaves of F. concinna var. subsessilis treated with different temperature

3 結論與討論

細胞膜是生物體與環境之間的界面結構，對維持生物體正常的生理生化過程有重要的作用。細胞膜是細胞感受環境脅迫最敏感的部位[18]也是低溫傷害的初始部位[19]。Lyons[20]認為，冷敏感植物在遭受低溫脅迫時，生物膜首先發生物相改變，由液晶相變為凝膠相，生物膜的透性發生不同程度的增大，細胞內的電解質外滲，引起導電性的變化，根據細胞導電性的差異，確定膜透性大小，從而推測膜的受傷程度和對寒冷的抗性強弱。電導法就是依據此原理檢測植物的抗寒性，并以相對電導率擬合Logistic方程求得LT50，以此比較植物在低溫下保持膜系統穩定性和完整性的能力判斷植物抗寒能力強弱[4]。

本實驗利用0、-2、-4、-6、-8℃ 5個溫度梯度對無柄小葉榕電解質滲出率進行測定。研究表明，電解質滲出率與處理溫度呈顯著負相關，整個電解質滲出率的變化趨勢呈緩慢、急劇、再緩慢的“S型變化趨勢。當溫度在-2℃到-6℃過程中，植物細胞膜破壞加強，細胞電解質滲出率急劇上升。當溫度低于-6℃時，細胞電解質滲出率增速變緩，說明膜透性幾乎完全被破壞。

有研究表明，植物組織遭受低溫脅迫時，膜透性發生變化，傷害程度不同，膜透性變化不同，但在輕度傷害時膜的透性是可恢復的。低溫對細胞膜傷害存在一個臨界溫度，低于臨界溫度時，對膜結構的破壞是可逆的[21]。在本研究中，在0℃到-2℃過程中，細胞電解質滲出率呈下降趨勢，-2℃時質膜傷害率低于0℃，這就是植物在初遇低溫時自我保護機制起作用的結果。

用電導法配合 Logistic方程計算材料的半致死溫度比較簡便，而且可靠性強，現已應用于多種植物材料耐寒性的測定[22~23]。本研究以小葉榕成熟葉片為材料，嚴格控制低溫處理和材料浸提的溫度與時間，然后利用低溫處理后的電解質滲出率值擬合Logistic方程，最后采用拐點法求得無柄小葉榕的半致死溫度為-3.95℃。但需要說明的是，在自然生長狀態下，植物體的生理狀況會隨外界環境因素的變化而發生改變，并會產生一系列適應性變化，逐漸形成其抗寒性[24]。人工低溫脅迫下，通過相對電導率來判斷植物的被傷害程度與抗寒能力，忽略了很多外來影響因素。因此，本研究所得到的葉片LT50，只是判別抗寒性差別的依據之一。要更為準確地對無柄小葉榕的抗寒能力做出科學判斷，不僅需要進行生理生化方面的多指標綜合分析，還需要進行自然狀態下的生理指標測定和低溫脅迫后恢復生長試驗等后續研究[25]。

[1] Agastian P, Kingsley S J, Vivekanandan M. Efect of salinity on photosynthesis and biochemical characteristics in mulberry genotypes[J]. Photosynthetica, 2000（38）：287-290.

[2] 林霞，鄭堅，陳秋夏，等. NaCl脅迫對無柄小葉榕光合作用和抗氧化酶活性的影響[J]. 北京林業大學學報，2011，33（44）：70-74.

[3] 林霞，鄭堅，劉洪見，等. 不同基質對無柄小葉榕容器苗生長和葉片生理特性的影響[J]. 林業科學，2010，46（8）：63-70.

[4] Dexter S T, Tottlngham W E, Graber L F. Preliminary results in measuring the hardiness of plants[J]. Plant Physiol, 1930, 5（2）：215-223.

[5] Sukumaran N P. An excise leaflet test for evaluating potato frost tolerance[J]. Hortisci, 1972（7）：467-468.

[6] Rajashekar C, Gusta L V, Burke M J. Membrane structural transition：probable relation to frost damage in hardy herbaceous species[A]. Lysons J M, Graham D, Raison J K. Low temperature stress in crop plants the role of membrane[M]. New York: Academic Press,1979:255-274.

[7] 孫程旭，曹紅星，陳思婷，等. 應用電導率法及Logistic方程測試蛇皮果抗寒性研究[J]. 江西農業學報，2009，21（4）：33-35.

[8] 孫程旭，陳良秋，馮美利，等. 檳榔不同品種幼苗耐寒性比較初步研究[J]. 江西農業學報，2009，22（6）：1 686-1 689.

[9] 朱根海，劉祖棋，朱培仁. 應用Logistic方程確定植物組織低溫半致死溫度研究[J]. 南京農業大學學報，1986（3）：11-16.

[10] 張德瞬，劉紅權，陳玉梅. 八種常綠闊葉樹種抗寒性的研究[J]. 園藝學報，1994，21（3）：283-287.

[11] 沈漫. 常春藤質膜透性和內源激素與抗寒性關系初探[J]. 園藝學報，2005，32（1）：141-144.

[12] 葛亞英. 兩種苦苣苔科花卉低溫半致死溫度的測定及耐寒生理變化研究[D]. 杭州：浙江大學，2010.

[13] 魏臻武，尹大海，王槐三. 電導法配合Logistic方程確定燕麥冰凍半致死溫度[J]. 青海畜牧獸醫雜志，1995，25(1) :11-13.

[14] 李俊才，劉成，王家珍，等. 洋梨枝條的低溫半致死溫度[J]. 果樹學報，2007，24（4）：529-532.

[15] 趙昌瓊，蘆站根，龐永珍，等. 曼地亞紅豆杉的半致死溫度與對低溫的適應性[J]. 重慶大學學報，2003，26（6）：86-88.

[16] 許怡玲，遇文婧，周玉遷，等. 低溫脅迫對玉簪根系活力的影響[J]. 林業科技，2010（3）：55-59.

[17] 莫惠棟. Logistic方程及其應用[J]. 江蘇農學院學報，1983，4（2）：53-57.

[18] 王洪春. 植物抗逆性與生物膜結構功能研究進展[J]. 植物生理學通訊，1985（1）：60-66.

[19] Levitt J. Responses of plants to environmental stresses [A]. Chilling, freezing, and high temperature stress[M]. New York：Academic Press, 1980. 67-290．

[20] Lyons J M. Chilling Injury in Plants[J]. AM Rev Plant Phys, 1973（24）：445-446.

[21] 高志紅，章鎮，韓振海. 果梅種質枝條抗寒性鑒定[J]. 果樹學報，2005，22（6）：709-711.

[22] 徐康，夏宜平，徐碧玉，等. 以電導法配合Logistic方程確定茶梅‘小玫瑰’的抗寒性[J]. 園藝學報，2005，32（1）：148-150.

[23] 熊燕，張萬民. 中國野生葡萄抗寒研究利用[M]. 安徽農業科學，2007，35（11）：3 238-3 239.

[24] 吳廣霞，唐獻龍. 植物低溫脅迫生理研究進展[J]. 作物雜志，2008（3）：17-19.

[25] 江福英，李延，翁伯琦. 植物低溫脅迫及其抗性生理[J]. 福建農業學報，2002，17（3）：190-195.

Determination of Cold Resistance of Ficus concinna var. subsessilis by REC with Logistic Equation

ZHANG Xiao-mian1，GAO Zhi-hui2*，LI Ming-liang3，YUE Chun-lei1，YUAN Xin-chang4，WU Min-xia5，WANG Yong1，LI He-peng1，CHEN Bin4

（1. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 2. Zhejiang Forestry Extension Station, Hangzhou 310020, China; 3. E’shan Township Government of Tonglu, Tonglu 311512, China; 4. Zhoushan Agro-forestry, Fishery and Rural Area Committee, Zhoushan 316021, China; 5. Wenling Forestry Extension Station of Zhejiang, Wenling 317500, China）

Electrolyte leakage in leaves of Ficus concinna var. subsessilis were determined under simulated low temperature and Logistic equation was fitted with curves of electrolyte leakage for calculating semi-lethal temperature (LT50). The results showed that electrolyte leakage rate had negative relation with decrease of temperature and the curve showed a typical“S”shape. Correlation coefficient was above 0.91 after test of significance, which met with logistic equation. LT50of F. concinna var. subsessilis was -3.95℃.

Ficus concinna var. subsessilis; electrolyte leakage rate; relative electric conductivity; Logistic equation; cold resistance

S718.51

A

1001-3776（2015）03-0026-05

2015-01-04；

2015-04-18

浙江省科技廳院所專項“千里沿海基干林帶建設關鍵技術研究與集成示范”（2012F30020）；浙江省林業廳省院合作項目“小葉榕耐寒種質資源的引選研究與示范”（2011SY04）、浙江省林業廳推廣項目“沿海基干林帶建設關鍵技術推廣與示范”（2012B32）

張曉勉（1983-），男，河南南陽人，助理研究員，博士，從事森林生態等研究；*通訊作者。