超高效液相色譜-串聯質譜法定量分析煙葉中的18種多酚

孔光輝 李勇逄濤 師君麗（云南省煙草農業科學研究院,玉溪653100）

超高效液相色譜-串聯質譜法定量分析煙葉中的18種多酚

孔光輝 李勇*E-mail：liyong189108@163.com逄濤 師君麗
（云南省煙草農業科學研究院,玉溪653100）

多酚是煙草重要的次生代謝物和香氣物質前體。本研究建立了一種煙葉中多酚的超高效液相色譜-串聯質譜定量分析方法,方法相對于現行行業標準（YC/T 202-2006,僅3個多酚指標）增加了15個新的分析指標。比較了不同比例的甲醇-水體系以及甲醇-水-氯仿體系（5∶2∶2,V/V）對煙葉中多酚的提取效果,發現甲醇-水-氯仿體系（5∶2∶2,V/V）的效果最佳。方法對所有被測多酚的線性相關系數（R2）均在0.99以上,檢出限在1～150μg/L之間,定量限在6～350μg/L之間,日內重復性在2.4％ ～6.5％之間,日間重復性在4.5％～10.1％之間,回收率在89.5％～103.7％之間,符合定量分析的要求。應用本方法檢測經不同溫度處理的煙草的多酚含量,發現在給定的實驗條件下,多酚對環境溫度變化的應答可分為隨溫度升高而降低、隨溫度升高而升高、無論溫度升高和降低,含量均降低、以及與溫度變化無顯著相關4種模式。

煙草；多酚；超高效液相色譜；串聯質譜

1 引 言

多酚是煙草重要的次生代謝物和香氣物質前體[1,2]。煙草多酚類化合物不僅直接影響煙葉顏色,而且對煙氣質量和香味也有間接影響,其降解產物還可以改善煙草制品的吸味,是衡量煙葉品質的重要指標[3]。煙草中多酚化合物的含量還可能與煙草的品質呈正相關關系[4]。

煙草中多酚類化合物主要包括單寧類（如綠原酸、咖啡酸）、香豆素類（如莨菪亭、七葉亭）和類黃酮（如蕓香苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷）,其中每類都有多個化合物[5～7]。而煙葉中多酚檢測的現行行業標準方法（YC/T 202-2006）涉及的多酚檢測指標僅包括綠原酸、蕓香苷和莨菪亭。部分新建立的分析方法逐步將新綠原酸、隱綠原酸、七葉亭、咖啡酸、山奈酚-3-蕓香糖等物質納入煙葉多酚分析指標[3,8～20]。2014年,本研究組建立了煙葉中類黃酮物質的結構鑒定方法,并從煙葉中鑒定出12種類黃酮物質[21]。2015年,本研究組建立了煙葉中12種類黃酮物質的定量分析方法[22]。而將12種類黃酮物質與其它6種多酚合并,建立起一種全面的多酚定量分析方法的報道尚未出現。

在前期工作基礎上,本研究建立了煙葉中18種多酚的定量分析方法。本方法對于開展多酚含量與煙草品質的相關研究以及多酚作為煙草次生代謝物對煙草抗蟲、抗病等相關研究具有重要意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（UPLC,美國Waters公司）,配AB SCIEX 5500三重四極桿質譜儀。SB-50D超聲波提取儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Waters BEH C18（15 cm×2.1 mm,1.7μm）反相色譜柱（美國Waters公司）；LD5-2A離心機（北京京立離心機有限公司）；CP2245分析天平（感量0.0001 g,德國Sartorious公司）。

甲醇和乙腈（色譜純,德國Merck公司）；超純水由Millipore純化系統制備；綠原酸（Chlorogenic acid,CLRGN acid）、隱綠原酸（Cryptochlorogenic acid,CCLRGN acid）、新綠原酸（Neochlorogenic acid, NCLRGN acid）、莨菪亭（Scopoletin）、七葉亭（Esculetin）、咖啡酸（Caffeic acid）、二氫山奈酚（Aromadendrin）、二氫槲皮素（Taxifolin）、槲皮素（Quercetin）、蕓香苷（Rutin）、山奈酚-3-O-蕓香糖苷（Kaempferol-3-O-Rutinoside,kaem-3-O-rut）、異鼠李素（Isorhamnetin）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Quercetin-3-O-Glucoside, quer-3-O-glu）、木犀草素（Luteolin）、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（Isorhamnetin-3-O-Glucoside,isor-3-O-glu）、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（Isorhamnetin-3-O-Rutinoside,isor-3-O-rut）、山奈酚-3-O-葡萄糖苷（Kaempferol-3-O-Glucoside,kaem-3-O-glu）、柚皮素-7-O-葡萄糖苷（Naringenin-7-O-Glucoside,nari-7-O-glu）等標準物質,以及黃豆苷元（Daidzein）、染料木苷（Genistin,葡萄糖基）、橙皮苷（Hesperidin,蕓香糖基）等內標物質,購于Sigma-Aldrich公司、Alfa Aesar公司和百靈威公司。

2.2 樣品前處理

樣品制備：將新鮮的煙葉樣品放入研缽,加液氮冷凍,并迅速研磨粉碎。磨好樣品迅速轉入凍干機進行冷凍干燥,除去水分,4℃保存備用。

樣品提取：準確稱取10.0 mg凍干煙葉樣本,加入1 mL提取劑和200μL內標溶液,超聲30 min,離心,取上清液轉入液相色譜進樣小瓶分析。

2.3 色譜-質譜分析條件

色譜分離條件和質譜離子源參數參照文獻[21],具體為（1）色譜分析條件 Waters BEH C18色譜柱（15 cm×2.1 mm,1.7μm）；流動相A為水,B為乙腈,兩相均添加0.1％ 甲酸和0.2mmol/L醋酸銨；流動相梯度：0～1 min,10％B；1～9 min,10％～90％B；9～11 min,90％～100％B；11～11.1 min, 100％～10％B；11.1～13 min,10％B；柱溫30℃,進樣量2μL,流速0.25 mL/min。（2）質譜分析條件

離子源,電噴霧電離離子源；噴霧電壓,-4000 V；簾氣壓力,0.276 MPa；離子源溫度,700℃；輔助氣1, 413685 Pa；輔助氣2,344738 Pa；去簇電壓,-100 V。

2.4 定量標準曲線的配制

初步估計,咖啡酸、七葉亭、二氫山奈酚、二氫槲皮素、槲皮素、異鼠李素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷等物質（以下稱“低濃度多酚”）的濃度梯度在1～10000μg/L之間,綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、莨菪亭、蕓香苷和山奈酚-3-O-蕓香糖苷（以下稱“高濃度多酚”）的濃度梯度在0.1～100 mg/L之間。因此先配制所有標準化合物的1 g/L的單標溶液（甲醇為溶劑）。分別移取100μL 1 g/L的低濃度多酚單標溶液以及10 mL 1 g/L的高濃度多酚單標溶液于100 mL容量瓶,以樣品提取溶液（甲醇-氯仿-水,5∶2∶2, V/V）定容,制成標準混合溶液。以樣品提取溶液逐級稀釋標準混合溶液,制成低濃度多酚濃度為1000, 600,400,100,60,40,10,6,4和1μg/L,體積為1 mL的標準溶液梯度。此梯度對應的高濃度標準溶液梯度為100,60,40,10,6,4,1,0.6,0.4和0.1 mg/L。在所有濃度梯度的溶液中加入200μL內標混合溶液。內標混合液為黃豆苷元、染料木苷、橙皮苷的水溶液,濃度為0.1 mg/L。黃豆苷元、染料木苷、橙皮苷分別用于校正無糖基多酚、葡萄糖基取代多酚和蕓香糖基取代多酚。

圖1 不同萃取溶劑對多酚的萃取效果比較Fig.1 Comparison of extraction yield using different extraction solutionsM,W and C stand formethanol,water and chloroform,respectively.

3 結果與分析

3.1 煙葉多酚萃取條件的優化

多酚含有多個酚羥基,具有一定的極性,文獻報道的多酚提取方法多采用不同比例的甲醇-水體系作為萃取劑[1,9,23,24]。作者曾考察不同萃取溶劑對類黃酮物質的萃取效果,結果表明,甲醇-氯仿-水（5∶2∶2,V/V）的萃取效果和色素去除效果均較好[20]。本實驗對比分析了不同比例的甲醇-水體系和甲醇-氯仿-水（5∶2∶2）,V/V）的萃取效果。結果表明,采用甲醇-水體系進行提取時,80％甲醇-水體系萃取的效果較好。但甲醇-氯仿-水（5∶2∶2,V/V）體系萃取效果明顯優于80％甲醇-水體系（圖1）。這可能是由于甲醇-氯仿-水（5∶2∶2,V/V）離心分層時剔除了色素物質,減少了質譜分析時色素等基質對多酚的電離抑制作用；另一方面,由于多酚不易溶于氯仿,離心分層后,氯仿層幾乎不含多酚,在萃取液總體積相同的情況下,氯仿層的分離相當于增加了多酚在上層中的濃度。本實驗采用甲醇-氯仿-水（5∶2∶2,V/V）體系進行多酚萃取。

3.2 多酚質譜分析方法的確定

采用流動注射的方法對質譜離子源參數和具體化合物的定量離子、碰撞能量等進行優化。其中質譜定量離子的選定方法為從標準化合物的二級質譜中初步選取4個較強的碎片離子,優化碰撞能,選取碰撞能最優時信噪比最大的兩個離子作為定量離子。最終得到定量分析的離子源參數見2.3節。化合物的定量離子及碰撞能量參數見表1。

表1 多酚分析質譜定量離子及碰撞能量Table 1 Quantitative ions and their related collision energies for polyphenols quantitation

1.NCLRGN acid：新綠原酸（Neochlorogenic acid）；2.CLRGN acid：綠原酸（Chlorogenic acid）；3.CCLRGN acid：隱綠原酸（Cryptochlorogenic acid）；7.Quer-3-O-glu：槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Quercetin-3-O-Glucoside）；8.Kaem-3-O-rut：山奈酚-3-O-蕓香糖苷（Kaempferol-3-O-Rutinoside）；9.Isor-3-O-rut：異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（isorhamnetin-3-O-Rutinoside）；10.Kaem-3-O-glu：山奈酚-3-O-葡萄糖苷（Kaempferol-3-O-Glucoside）；11.Isor-3-O-glu：異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（Isorhamnetin-3-O-Glucoside）；14.Nari-7-O-glu：柚皮素-7-O-葡萄糖苷（Naringenin-7-O-Glucoside）.

3.3 多酚定量分析方法驗證

多酚的色譜分離效果見圖2。按照2.4節所述的方法繪制標準曲線,發現所有化合物的線性相關系數（R2）均大于0.99,說明本方法適合定量分析。對這些化合物進行定量限和檢出限評估,發現不同化合物的檢出限和定量限相差較大,其中咖啡酸、莨菪亭、七葉亭、異鼠李素-3-葡萄糖苷、二氫槲皮素、柚皮素-7-葡萄糖、二氫山奈酚、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷的定量限可達到6～9μg/L；而綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、蕓香苷、山奈酚-3-O-蕓香苷以、木犀草素、槲皮素、異鼠李素等的定量限在0.08～0.35 mg/L之間（表2）。對多酚進行重復性考察,發現所考察的多酚的日內重復性在2.4％～6.5％之間,日間重復性在4.5％～10.1％之間（表3）。根據多酚在本實驗所測定的11種煙草中的平均濃度,添加平均濃度約50％和100％的標準樣品至實際樣品中,測得本方法回收率,在89.5％～103.7％之間（表3）。

表2 多酚化合物的校準曲線、檢出限和定量限Table 2 Linear regression curves,limits of detection and limits of quantitation of the determined polyphenols

表3 多酚化合物的重復性和回收率Table 3 Reproducibility and recovery of the determined polyphenols

3.4 不同環境溫度處理煙草的多酚差異研究

利用所建立的多酚定量分析方法,對不同環境溫度（低溫18.5℃、常溫23.5℃、高溫28.5℃）生長的煙草進行多酚主成分分析（圖3）,結果表明,高溫和低溫處理的煙草多酚整體輪廓相對常溫對照發生了明顯變化。而這些變化的主要來源為綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、莨菪亭、蕓香苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷等（圖4）。其中,綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸等多酚隨著溫度的降低而升高,且低溫對綠原酸及其異構體的影響比高溫明顯。低溫和高溫處理煙草的綠原酸及其異構體的含量總和分別是常溫對照的2.93倍和0.62倍。溫度對莨菪亭的影響與綠原酸及其異構體不同。高溫和低溫均會降低莨菪亭的含量。其中高溫和低溫處理煙草中莨菪亭含量分別為為常溫的0.22倍和0.47倍。煙草中蕓香苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量與溫度的關系與綠原酸相反,隨著溫度的降低而減少,只是其變化的幅度沒有綠原酸大。其余多酚在不同溫度處理煙草間含量分布未見顯著性差異。不同多酚的變化趨勢差異說明煙草中多酚在應對環境溫度改變時所采取的策略各不相同。其應對策略可歸納為4類：隨溫度的升高而升高、隨溫度的升高而降低、溫度升高或降低時均降低、以及與溫度變化無顯著變化關系。

圖2 多酚的色譜分離圖Fig.2 Chromatogram of polyphenols圖中數字編號對應的多酚名稱見表1中多酚編號對應的名稱。Names of the numbered polyphenols can be found in Table 1.

圖3 不同溫度生長煙草多酚的主成分分析得分圖Fig.3 Principal components analysis of tobacco planted at differentenvironment temperatures using the polyphenol data

圖4 差異性多酚的含量分布圖Fig.4 Concentration distribution of differential polyphenols注：圖中“**”和“*”分別表示組間差異p值小于0.01和0.05。“**”and“*”stand for the p value of significance less than 0.01 and 0.05,respectively.H,N and L stand for High temperature,normal temperature and low temperature,respectively.

4 結論

本研究建立LC-MS/MS定量分析煙葉中18種多酚的方法。本方法將現有多酚分析方法的分析指標擴展到18個。方法簡單、快速、準確、覆蓋面廣。將本方法用于不同環境溫度處理煙草的研究發現,不同類型多酚對外界環境變化的應對方式各不相同。本方法的建立對從事煙草多酚相關研究具有參考意義。

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（Received 6 September 2015；accepted 21 October 2015）

Quantitation of 18 Polyphenols in Tobacco Leaf Using Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem M ass Spectrometry

KONG Guang-Hui,LIYong*,PANG Tao,SHIJun-Li
（Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Science,Yuxi653100,China）

Polyphenols are very important secondary metabolites for tobacco plants.They are also considered as the important flavor precursors for cigarette industry.A liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）-based method was established for the simultaneous determination of 18 polyphenols in tobacco leaf.The developed method can be used to determine 15 more polyphenols compared to the standard method for industry（YC/T 202-2006）.Different kinds of extraction solution were compared and a solution of methanol-water-chloroform（5∶2∶2,V/V）was selected for the extraction because of its highest yield.Method validation was performed and the result showed that all the 18 polyphenols have their linear correlation coefficients（R2）more than 0.99.The low limit of determination and the low limit of quantitation were in the range of 1-150μg/L and 6-350μg/L,respectively.Intra-day and Inter-day reproducibility were in the range of2.4％-6.5％and 4.5％-10.1％,respectively.Recoverieswere in the range of 89.5％-103.7％.The established method was then successfully used to analyze polyphenols of tobacco leaves planted under different environment temperatures.The polyphenols can be classified in four groups based on their response to the temperature changing：the concentration increase with the increasing environment temperature,the concentration decrease with the increasing environment temperature,the concentration decrease with the environment temperature changes from the normal set point,and the concentration does not change significantly with the changing environment temperature.

Tobacco；Polyphenols；Ultra performance liquid chromatography；Tandem mass spectrometry

10.11895/j.issn.0253-3820.150706

2015-09-06收稿；2015-10-21接受

本文系云南省煙草專賣局基金資助項目（No.2014YN11）