七葉皂苷鈉對腦缺血再灌注損傷大鼠炎性細胞因子的影響

張雪梅，騫秀芳

七葉皂苷鈉對腦缺血再灌注損傷大鼠炎性細胞因子的影響

張雪梅1，騫秀芳2

目的 觀察七葉皂苷鈉對腦缺血再灌注(CI/R)損傷大鼠腦組織中炎性細胞因子的影響，探討其作用機制。方法 采用四血管阻塞10 min的方法建立CI/R大鼠模型，并進行12 h再灌注，試驗分為假手術組、模型組及七葉皂苷鈉高、中、低劑量組(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)，術前3 d開始腹腔注射給藥，每天1次，術后1 h給藥1次。再灌注12 h后，ELISA法檢測腦勻漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平。結果 七葉皂苷鈉高、中劑量可顯著降低CI/R損傷大鼠的神經行為學評分，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。七葉皂苷鈉各劑量均能降低CI/R損傷大鼠腦組織的TNF-α水平，高、中劑量可明顯降低腦組織IL-1β的表達水平，與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 七葉皂苷鈉預處理對CI/R損傷大鼠的腦保護作用可能與其減少炎性細胞因子的過度釋放有關。

腦缺血再灌注損傷； 七葉皂苷鈉；腫瘤壞死因子-α；白介素-1β

腦缺血再灌注(CI/R)損傷約占腦血管損傷原因的60%，防治由CI/R引起的腦血管損傷具有重要的臨床意義[1]。近年來對CI/R損傷的研究取得了較大進展，但迄今臨床上仍缺乏理想的治療藥物。七葉皂苷鈉(Sodium aescinate)是由七葉樹果實娑羅子中提取的三萜皂苷鈉鹽。研究表明，七葉皂苷鈉具有抗炎、抗滲出、消水腫以及改善血液循環等作用[2-3]。據報道，七葉皂苷鈉對CI/R損傷具有確切的保護作用[4]，然其作用機制仍不清楚。本研究探討七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠炎性細胞因子的影響，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重240 g～280 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003。動物分籠飼養，適應性喂養1周后進行試驗。

1.2 藥品和試劑 注射用七葉皂苷鈉，購自北京四環科寶制藥有限公司。大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；電子勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；高速冷凍離心機，中國科大創新股份有限公司產品；紫外分光光度計，日本島津公司。

1.4 CI/R損傷大鼠模型的制備 采用四血管阻塞法建立全腦缺血再灌注動物模型[5]。取SD大鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，頸中切口，分離第一頸椎雙側的橫突孔，電凝雙側椎動脈并分別用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈，10 min后恢復血流灌注，常規縫合頸部切口，再灌注12 h。造模成功標準：夾閉頸總動脈后30 s～60 s內動物昏迷，睫毛反射消失，瞳孔放大，眼球變白，松開動脈夾后20 s～30 s，眼球恢復紅色，意識恢復，并可以活動。剔除術后出現意外的大鼠，如誘發癲癇、肢體癱瘓、意識障礙、死亡等，并予以補齊。

1.5 分組和給藥 取成模大鼠40只，隨機分為：模型組，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)，每組10只。另取10只大鼠，不電凝雙側椎動脈，也不夾閉雙側頸總動脈，其余操作同成模大鼠，作為假手術組。術前3 d各組開始腹腔注射給藥，均按10 mL/kg每天給藥1次，術后1 h給藥1次，假手術組和模型組按等體積給予生理鹽水。

1.6 指標檢測

1.6.1 神經行為學評分 再灌注10 h后，按文獻方法對各組大鼠進行神經行為學評分[6]，包括運動、感覺、反射以及平衡試驗，最低0分，最高18分，1分～6分為輕度損害，7分～12分為中度損害，13分～18分為重度損害。

1.6.2 腦勻漿TNF-α和IL-1β的檢測 再灌注12 h后，各組動物斷頭，取腦部，在冰浴生理鹽水中漂洗除血，濾紙拭干，稱重，電動勻漿機研磨，加冰浴生理鹽水制成10%腦勻漿，冷凍離心機中5 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法測定TNF-α和IL-1β的表達水平，操作按試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠神經行為學評分的影響 假手術組評分為0，不納入統計學比較。模型組評分為(7.04±1.19)分，七葉皂苷鈉高、中劑量可分別降低神經行為學評分為(6.24±0.95)分、(6.29±0.87)分，與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.2 七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠腦組織TNF-α和IL-1β水平的影響 模型組大鼠腦組織勻漿中TNF-α和IL-1β水平均顯著高于假手術組(P< 0.01)。七葉皂苷鈉各劑量均能降低CI/R損傷大鼠腦組織的TNF-α水平，與模型組比較差異有統計學意義(P< 0.05)。七葉皂苷鈉高、中劑量均明顯降低CI/R損傷大鼠腦組織IL-1β的表達水平(P< 0.05)，與模型組比較差異有統計學意義(P< 0.05)。詳見表1。

表1 七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠TNF-α和IL-1β的影響(±s) μg/(g·Pro)

3 討 論

近年來，藥物預處理是防治CI/R損傷提出的新理念，通過藥物預處理阻斷神經元損傷的病理生理環節，增加機體內源性保護物質，在CI/R損傷的防治中具有重要意義[7]。本研究采用術前3 d開始給藥的預處理方式，觀察七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠的腦保護作用，結果顯示七葉皂苷鈉各劑量明顯降低了CI/R損傷大鼠的神經行為學評分，說明七葉皂苷鈉預處理能減輕CI/R損傷的神經癥狀，具有一定的神經保護作用。急性炎癥反應是CI/R中引發繼發性腦損傷的主要原因之一[8]。TNF-α和IL-1β是機體炎癥反應和免疫應答的重要細胞因子，CI/R發生時由神經元、神經膠質細胞、血管內皮細胞和血管周圍的炎性細胞分泌產生，過度表達的TNF-α和IL-1β可觸發炎癥反應，啟動多種介質的級聯反應，加重腦組織損害[9-10]。陳素輝等[11]研究表明，CI/R大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的表達在再灌注12 h～144 h后均有所升高，且顯著高于假手術組和正常組。因此，抑制炎癥介質的過度產生，對于改善CI/R損傷有著重要意義。

本研究結果顯示，CI/R損傷大鼠在再灌注12 h后腦組織中TNF-α和IL-1β的表達水平有顯著升高，提示炎性因子的釋放參與了CI/R損傷的病理過程，這與文獻報道[9-11]的結果一致。七葉皂苷鈉各劑量均能下調CI/R損傷大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的表達，并能緩解神經行為學癥狀，提示七葉皂苷鈉的作用機制可能是通過抑制炎癥介質如TNF-α和IL-1β的表達，從而減輕炎癥級聯反應，實現對CI/R損傷的腦保護作用。

七葉皂苷鈉預處理對CI/R損傷大鼠的保護作用是通過下調腦組織中TNF-α和IL-1β等炎癥因子的表達、減輕腦組織的炎癥反應等途徑實現的。

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(本文編輯 王雅潔)

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Influence of Sodium Aescinate on Inflammatory Cytokines in Rats with Cerebral Ischemia/reperfusion Injury

Zhang Xuemei，Qian Xiufang Beijing Armed Police Forces Hospital， Beijing 100027，China

Corresponding Author：Qian Xiufang(The Second Hospital of Beijing Armed Police Forces， Beijing 100027，China)

Objective To investigate the effect of sodium aescinate (SA) on inflammatory cytokines in rats with cerebral ischemia/reperfusion (CI/R) injury.Methods Rat model of CI/R was prepared by four-vessel occlusion for 10 min followed by 12-hour reperfusion.Rats were then randomly divided into 5 groups (n=10)，namely sham group， model group，SA high，medium and low dose groups (10，20 and 40 mg/kg).Drugs were i.p.administered once a day for 3 days before the operation and once 1 hour after the operation，respectively.The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α)， interleukin (IL)-1β in brain tissue homogenate were measured by ELISA after 12-hour reperfusion.Resluts The neurological behavior scores in SA high dose group and SA medium dose group were lower than that in model group(P<0.05).The levels of brain TNF-αin SA groups were significantly lower than that in model group (P<0.05).The levels of brain IL-1β in SA high dose group and SA medium dose group were lower than that in model group(P<0.05). Conclusion SA pretreatment can inhibit inflammatory cytokines in brain tissue in rats with CI/R injury.

sodium aescinate；cerebral ischemia/reperfusion injury； tumor necrosis factor-α；interleukin-1β

1.武警北京總隊醫院(北京 100027)；2.武警北京總隊第二醫院

騫秀芳，E-mail：158130707@qq.com

R743 R285

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.009

1672-1349(2015)17-1943-03

2015-02-26)