黃芪甲苷對腦缺血再灌注后腦組織MPO活性及 TNF-α、IL-1β含量的影響

曲友直，段君民，曹 鵬，拓 柯，楊 棟

黃芪甲苷對腦缺血再灌注后腦組織MPO活性及 TNF-α、IL-1β含量的影響

曲友直1，段君民2，曹 鵬2，拓 柯2，楊 棟2

目的 探討黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注后腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)含量的影響。方法 將36例只SD大鼠物隨機分為假手術組、模型組、黃芪甲苷治療組，每組12只。采用分光光度法及酶聯免疫吸附法分別檢測各組大鼠腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量。結果 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，黃芪甲苷治療組大鼠腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量明顯減少(P<0.05)。結論 黃芪甲苷可下調腦缺血再灌注后MPO活性及TNF-α、IL-1β含量，從而減輕炎癥反應，發揮腦保護作用。

腦缺血再灌注；黃芪甲苷；髓過氧化物酶；腫瘤壞死因子-α；白介素-1β

黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分[1]。已有研究表明黃芪甲苷具有縮小腦梗死體積、減輕缺血再灌注后腦水腫、抗凋亡等作用，但目前作用機制尚不明確[2-4]。近年來發現炎癥反應是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因，其核心是中性粒細胞的黏附和浸潤，髓過氧化物酶 (myeloperoxidase，MPO)活性是評價中性粒細胞組織浸潤程度的可靠指標。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)均為具有多效作用的促炎性細胞因子，是炎癥反應中的關鍵細胞因子[5，6]。本研究通過觀察黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注后腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量的影響，探討黃芪甲苷對腦缺血再灌注損傷起保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品及試劑 成年雄性SD大鼠36只，清潔級，體重250 g～300 g，購于第四軍醫大學實驗動物中心。黃芪甲苷購于中國藥品生物制品檢定所。MPO測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。TNF-α、IL-1β定量ELISA測定試劑盒，購于美國BIOSOUCE公司。

1.2 動物分組及模型制備 36只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、黃芪甲苷治療組(治療組)，每組12只。假手術組栓線僅插入頸總動脈6 mm，不阻塞大腦中動脈，其余步驟同模型組。模型組參照Zea Longa[7]報道的方法，采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。結扎大鼠頸總和頸外動脈，自頸總動脈分叉處向頸內動脈插入栓線18.5 mm±0.5 mm，阻斷大腦中動脈血流，造成局灶性腦缺血，術后將栓線尾部置于皮下，缺血1.5 h后輕拔栓線造成血流再灌注24 h，再灌注即刻經腹腔注射等體積生理鹽水。黃芪甲苷治療組造模后再灌注即刻經腹腔注射黃芪甲苷20 mg/kg。

1.3 MPO活性檢測 再灌注24 h后，每組中隨機取6只大鼠處死，取缺血側腦組織(假手術組取假手術側)超聲粉碎(30 s，3次)，4 ℃10 000 r/min離心15 min，保持溫度25 ℃，取上清液于分光光度計下立即進行掃描，檢測MPO活性。

1.4 TNF-α、IL-1β含量檢 每組中另外6只大鼠再灌注24 h后斷頭取腦，于冰盤上迅速剝離缺血側大腦皮質(假手術組取假手術側)，加入生理鹽水勻漿，4 ℃3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β含量。具體操作步驟嚴格按TNF-α、IL-1β定量ELISA試劑盒說明書進行。

2 結 果

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織 MPO活性及TNF-α、IL-1β含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷治療組大鼠腦組織MPO活性、TNF-α及IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注MPO活性及TNF-α、IL-1β含量的影響(x±s)

3 討 論

腦缺血再灌注損傷的炎癥反應是一個復雜的級聯反應過程。中性粒細胞的黏附和浸潤是炎癥反應的核心，其通過多種機制介導缺血再灌注后腦損傷[8]：中性粒細胞黏附、聚集造成微血管阻塞，血流量減少；大量氧自由基產生，引起脂質過氧化反應；釋放細胞毒性蛋白降解細胞外基質成分，增加血腦屏障通透性；血管通透性增加、引發腦水腫。MPO主要存在于中性粒細胞嗜天青顆粒中，因此作為中性粒細胞的標記物，其活性定量反應白細胞浸潤的數量，是評價中性粒細胞在組織中浸潤程度的可靠指標[9]。本實驗結果顯示，模型組MPO活性較假手術組顯著升高，表明中性粒細胞浸潤與腦缺血再灌注損傷關系密切，炎癥反應參與了腦缺血再灌注損傷。

本實驗結果還顯示，腦缺血再灌注后TNF-α、IL-1β含量顯著升高。TNF-α、IL-1β均為具有多效性作用的促炎性細胞因子，在腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用。TNF-α可通過以下幾種途經參與腦缺血再灌注損傷[9]：促進炎性趨化因子生成、誘導白細胞聚集；激活腦內磷脂酶A2；刺激血管激活因子釋放，增加血腦屏障通透性；刺激血管內皮細胞合成和表達白介素-1(IL-1)、IL-8、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)等，促進白細胞黏附于毛細血管壁。IL-1β是啟動炎癥反應的關鍵細胞因子之一，在腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用，其作用機制主要有以下幾個方面[10]：增加缺血腦組織興奮性氨基酸的神經毒性；增加腦缺血神經細胞Ca2+超載；刺激內皮細胞表達白細胞黏附因子、白細胞介素-8；誘導神經元凋亡基因表達，促進細胞凋亡。

本實驗結果表明，黃芪甲苷可顯著下調缺血再灌注后腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分，常作為黃芪及含黃芪的中成藥定性定量評價指標[1]。已有研究表明黃芪甲苷具有降低腦缺血再灌注后自由基含量、抗凋亡、縮小梗死體積、上調ZO-1及occludin蛋白表達、改善血腦屏障通透性等作用，但目前作用機制尚不完全明確[2-4]。本研究表明黃芪甲苷可通過降低腦缺血再灌注后關鍵細胞因子TNF-α、IL-1β在腦組織中含量，從而抑制腦組織MPO活性、減少中性粒細胞的黏附和浸潤、保護神經細胞及血腦屏障的完整。這可能是黃芪甲苷發揮對腦缺血再灌注后血腦屏障保護作用的分子機制之一。

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(本文編輯 郭懷印)

Effects of Astragaloside Ⅳ on the Activity of MPO and the Content of TNF-α，IL-1β after Cerebral Ischemia and Reperfusion

Qu Youzhi， Duan Junming，Cao Peng，Tuo Ke，Yang Dong

Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，Xi’an 710038，Shaanxi，China

Objective To investigate the effects of astragaloside Ⅳ on the activity of myeloperoxidase(MPO) and content of tumor necrosis factor alpha(TNF-α)， interleukin-1 beta(IL-1β) after cerebral ischemia and reperfusion.Methods Thirty-six Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into sham-operated group，model group，astragaloside Ⅳ group.The methods of pectrophotometry and ELISA were respectively used to measure the activity of MPO and the content of TNF-α，IL-1β in brains tissue.Results Compared with those in sham-operated group，the activity of MPO and the content of TNF-α，IL-1β increased significantly in model group(P<0.01).Compared with those in model group， the activity of MPO and the content of TNF-α，IL-1β decreased significantly in astragaloside Ⅳ group (P<0.05).Conclusion Astragaloside Ⅳ can decrease the activity of MPO and the content of TNF-α，IL-1β after cerebral ischemia and reperfusion， and alleviate inflammation reaction which may be one of mechanisms of neuroprotective effects of astragaloside Ⅳ on cerebral ischemia and reperfusion injury.

cerebral ischemia and reperfusion injury；astragaloside Ⅳ；myeloperoxidase；tumor necrosis factor alpha；interleukin-1 beta

國家自然科學基金項目(No.30600841)

1.中國人民解放軍第四軍醫大學唐都醫院(西安 710038)，E-mail：quyouzhi210@163.com；2.中國人民解放軍第五三八醫院

R741 R285.5

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．14．012

1672-1349(2015)14-1620-02

2015-02-02)