蝙蝠葛活性成分體內(nèi)外抗腫瘤作用研究*

張 淼李 默丁 寧

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江，哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

·研究報(bào)告·

蝙蝠葛活性成分體內(nèi)外抗腫瘤作用研究*

張 淼1李 默1丁 寧2△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江，哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

目的探討蝙蝠葛活性成分在體內(nèi)外抗腫瘤的作用。方法將30只BALB/cA裸小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物低劑量組、藥物高劑量組。進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，在細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)之后，進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。使用MTT比色法按照實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。每周對(duì)所有小鼠測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)度、寬度，動(dòng)態(tài)觀察裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況，并計(jì)算體積，制作裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)去曲線圖。結(jié)果蝙蝠葛活性成分對(duì)人肺癌A-549細(xì)胞株，人肝癌HepG2細(xì)胞株，人肝癌Hep3B細(xì)胞株，人宮頸癌Hela細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株、人白血病K-562細(xì)胞株、人胃癌MGC-803細(xì)胞株、人胃癌SGC-7901細(xì)胞株和小鼠黑色素瘤B-16細(xì)胞株均有明顯抑制增殖作用。藥物低劑量組的T/C值為68.4%，對(duì)裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)無(wú)明顯地抑制作用；藥物高劑量組的T/C值為58.8%（P＜0.05）。結(jié)論蝙蝠葛活性成分在體外具有較強(qiáng)的廣譜抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，且高劑量組蝙蝠葛對(duì)移植腫瘤的抑制效果非常明顯。

蝙蝠葛 生物活性 腫瘤

蝙蝠葛的藥理作用研究在臨床上已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，特別是在其生物活性的研究中進(jìn)展較大，許多文獻(xiàn)資料也認(rèn)可了該藥物的應(yīng)用前景［1-2］。現(xiàn)代醫(yī)藥研究認(rèn)為，蝙蝠葛具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤作用［3-4］，并在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。本研究主要針對(duì)蝙蝠葛活性成分在體內(nèi)外抗腫瘤的作用，通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法，進(jìn)行一定的討論研究，為臨床醫(yī)學(xué)提供一定的參考。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/cA裸小鼠，體質(zhì)量（21±1）g，雄性（45～50）d，由中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所提供。

1.2 模型制備 首先進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，在細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)之后 （包括人肺癌A-549細(xì)胞株、人肝癌HepG2細(xì)胞株、人肝癌Hep3B細(xì)胞株、人宮頸癌Hela細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株、人白血病K-562細(xì)胞株、人胃癌MGC-803細(xì)胞株、人胃癌SGC-7901細(xì)胞株和小鼠黑色素瘤B-16細(xì)胞株等），并存并進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。使用MTT比色法按照實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，最后將人肺癌A-549細(xì)胞裸鼠皮下移植，取生長(zhǎng)旺盛期的腫瘤組織剪切成1.5 mm3左右，在無(wú)菌條件下接種于裸小鼠背部皮下，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑［5-7］。

1.3 給藥方法 將待裸小鼠移植瘤生長(zhǎng)至100～200mm3后將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，陰性對(duì)照組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.2 mL，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg，藥物低劑量組腹腔注射蝙蝠葛酚性堿5 mg/kg，藥物高劑量組腹腔注射蝙蝠葛酚性堿20 mg/kg。每日1次，連續(xù)20 d。

1.4 抑瘤效果標(biāo)準(zhǔn) 每周對(duì)所有小鼠測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)度、寬度，動(dòng)態(tài)觀察裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況，并計(jì)算體積，制作裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)去曲線圖，并稱取小鼠的體質(zhì)量。其中抗腫瘤藥物的活性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為，相對(duì)腫瘤增值率大于60%為無(wú)效，小于等于60%并經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為有效［8］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.00統(tǒng)計(jì)軟件處理。組間使用LSD法比較。P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 蝙蝠葛活性成分體外抑制細(xì)胞增殖作用 MTT結(jié)果顯示蝙蝠葛活性成分對(duì)人肺癌A-549細(xì)胞株、人肝癌HepG2細(xì)胞株、人肝癌Hep3B細(xì)胞株、人宮頸癌Hela細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株、人白血病K-562細(xì)胞株、人胃癌MGC-803細(xì)胞株、人胃癌SGC-7901細(xì)胞株和小鼠黑色素瘤B-16細(xì)胞株均有明顯抑制增殖作用。見表1。

表1 蝙蝠葛活性成分體外抑制細(xì)胞增殖作用（±s）

表1 蝙蝠葛活性成分體外抑制細(xì)胞增殖作用（±s）

同一種細(xì)胞不同濃度之間與前一組比較，*P＜0.05。

細(xì)胞株 質(zhì)量濃度（μ g / m L）2 . 5 2 0 A -5 4 9 3 3 . 2 1 ± 1 . 3 4 8 6 . 2 7 ± 1 . 0 5*H e p G 2 2 7 . 6 5 ± 1 . 0 1 8 9 . 0 1 ± 0 . 2 5*1 0 4 5 . 1 2 ± 1 . 3 1*7 1 . 2 5 ± 0 . 8 2*4 8 . 2 1 ± 2 . 6 1*6 8 . 2 8 ± 0 . 5 6*H e p 3 B 2 7 . 3 5 ± 0 . 9 4 8 1 . 5 1 ± 1 . 0 8*5 4 0 . 2 5 ± 0 . 1 8*6 0 . 3 1 ± 1 . 1 2*H e l a 3 5 . 9 1 ± 1 . 3 5 4 5 . 9 9 ± 1 . 6 7*7 7 . 4 5 ± 0 . 3 1*9 0 . 2 1 ± 0 . 3 8*M C F -7 4 9 . 0 1 ± 2 . 3 1 5 5 . 2 6 ± 1 . 0 5*8 8 . 0 4 ± 0 . 1 8*9 3 . 0 1 ± 0 . 5 1*K -5 6 2 5 1 . 2 6 ± 1 . 2 4 6 1 . 2 8 ± 3 . 3 3*8 1 . 5 4 ± 0 . 8 4*9 7 . 2 1 ± 0 . 6 1*M G C -8 0 3 3 7 . 9 1 ± 1 . 2 1 5 2 . 3 1 ± 1 . 8 7*7 7 . 6 4 ± 0 . 8 4*8 1 . 3 4 ± 0 . 6 7*S C G -7 9 0 1 3 9 . 0 5 ± 1 . 0 2 5 5 . 0 4 ± 2 . 1 2*7 8 . 9 4 ± 0 . 4 5*8 6 . 0 4 ± 0 . 3 4*B -1 6 2 5 . 0 2 ± 1 . 3 7 3 9 . 5 7 ± 3 . 6 4*6 7 . 0 2 ± 3 . 0 8*8 1 . 0 5 ± 2 . 3 1*

2.2 蝙蝠葛活性成分抗腫瘤結(jié)果 蝙蝠葛活性成分對(duì)人肺癌A-549裸小鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)性治療結(jié)果見表2所示：蝙蝠葛活性成分低劑量組的T/C值為68.4%，對(duì)裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)無(wú)明顯地抑制作用；蝙蝠葛活性成分高劑量組的T/C值為58.8%（P＜0.05）。故可以認(rèn)為對(duì)裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)具有抑制增殖作用。各實(shí)驗(yàn)組裸鼠生長(zhǎng)情況良好，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均無(wú)死亡，蝙蝠葛活性成分組體質(zhì)量均有增加，與陰性對(duì)照組裸鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），絲裂霉素組體質(zhì)量相對(duì)較輕。

表2 各組裸鼠體質(zhì)量、皮下移植瘤結(jié)果比較

3 討 論

通過(guò)MTT檢測(cè)法筆者檢測(cè)到了蝙蝠葛活性成分對(duì)人肺癌A-549細(xì)胞株、人肝癌HepG2細(xì)胞株、人肝癌Hep3B細(xì)胞株、人宮頸癌Hela細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株、人白血病K-562細(xì)胞株、人胃癌MGC-803細(xì)胞株、人胃癌SGC-7901細(xì)胞株和小鼠黑色素瘤B-16細(xì)胞株均有明顯的抑制增殖作用，其中對(duì)人白血病K-562細(xì)胞作用最強(qiáng)。此外，對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株也表現(xiàn)出了較好的抗增殖作用，蝙蝠葛活性成分對(duì)上述9種腫瘤細(xì)胞株均呈現(xiàn)出了濃度依賴性，即隨著藥物濃度的增高，其細(xì)胞抑制率也明顯升高，并且其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在相關(guān)文獻(xiàn)資料的研究當(dāng)中，筆者發(fā)現(xiàn)，蝙蝠葛的活性成分可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等［9-10］。許多學(xué)者也通過(guò)大量的試驗(yàn)證實(shí)了蝙蝠葛對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、遷移等方面的作用，而本研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)蝙蝠葛的活性藥物比較，在裸鼠實(shí)驗(yàn)中取得了較為理想的效果，從一定程度上可以認(rèn)為蝙蝠葛活性成分在體外具有廣譜的抗腫瘤作用。

在腫瘤相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中，裸小鼠應(yīng)用非常廣泛［11］，且受到了諸多學(xué)者的喜愛(ài)，主要就是由于裸小鼠在腫瘤實(shí)驗(yàn)當(dāng)中的有效性，特別是在惡性腫瘤的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，由于裸鼠為無(wú)胸腺動(dòng)物，其中的依賴性免疫功能缺失，也就是說(shuō)該鼠的T細(xì)胞功能缺乏，但是其B細(xì)胞卻又非常正常，在腫瘤細(xì)胞的抑制過(guò)程中排斥性較小，最為中立抑制方面的試驗(yàn)效果非常顯著；且由于裸鼠沒(méi)有毛，在臨床試驗(yàn)的操作過(guò)程中非常的便捷，僅需要每組5只左右就可以完成試驗(yàn)。本研究過(guò)程中筆者發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用人肺癌A-549裸小鼠移植瘤進(jìn)行蝙蝠葛的抗腫瘤作用觀察效果也非常明顯，試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)裸鼠死亡病例，而在結(jié)果的比較當(dāng)中，低劑量組的蝙蝠葛抗腫瘤作用不是非常明顯，雖然具有一定的效果，但整體而言并不理想，然而在高劑量組當(dāng)中，效果非常顯著，T/C值為58.8%，與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且小鼠各組之間的體質(zhì)量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在小鼠移植腫瘤平均體積比較中，使用高劑量組的小鼠體積最小，與陰性對(duì)照組差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明高劑量組蝙蝠葛對(duì)移植腫瘤的抑制效果非常明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)，蝙蝠葛在抗腫瘤中具有一定的作用，蝙蝠葛活性成分在體外具有較強(qiáng)的廣譜抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，且對(duì)體內(nèi)抑制的腫瘤也具有一定的抑制作用。因此，在蝙蝠葛在研究可以進(jìn)步一的進(jìn)行，具有較強(qiáng)的臨床研究?jī)r(jià)值，值得臨床或?qū)嶒?yàn)醫(yī)學(xué)繼續(xù)研究和探討。

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The Anti-tumor Effects in Vitro and Vivo of Active Component in Dauricine

ZHANG Miao，LI Mo，DING Ning. The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Tradition Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China

Objective：To investigate the anti-tumor effects in vitro and vivo of active component in dauricine.Methods：30 BALB/cA nude mice were divided into the negative control group，the positive control group，the low-dose group of the active component and the high-dose group of active component cells were cultured in vitro. After cell recovery and culture，cell viability was tested.MTT colorimetric test was conducted in accordance with standard procedures.Weekly，the length and width of the transplanted tumor were measured.The growth in nude mice was dynamically observed，and the volume and growth were calculated in nude mice to make graphs.Results：Active component of dauricine had an inhibitory effect on human cancers，such as cell line A-549 in lung cancer，cell line HepG2 and Hep3B in hepatoma，cell line Hela in cervical cancer，cell line MCF-7 in breast cancer，cell line K-562 in leukemia，cell line MGC-803 and SGC-7901 in gastric cancer as well as inhibited proliferation on cell line B-16 in mouse melanoma.In the low dose group，T/C value was 68.4%with no significant inhibitory effect；in the low dose group，T/C value was 58.8%（P＜0.05）.Conclusion：Active component of dauricine in vitro has a strong broad-spectrum anti-tumor cell proliferation，and dauricine has an obvious inhibitory effect on transplanted tumor in the high-dose group.

Menispermum dauricum；Biological activities；Tumor

R285.5

A

1004-745X（2015）08-1330-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.006

2015-04-05）

黑龍江省自然基金面上資助項(xiàng)目（H201319）；黑龍江省博士后資助項(xiàng)目（LBH-Z12253）

△通信作者（電子郵箱：ningning_680512＠163.com）