潰瘍性結腸炎（脾腎陽虛證）大鼠模型的實驗研究*

王燚霈 朱 瑩王 璇

（湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

·研究報告·

潰瘍性結腸炎（脾腎陽虛證）大鼠模型的實驗研究*

王燚霈 朱 瑩△王 璇

（湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

目的研制與臨床證候相吻合的切實可行的潰瘍性結腸炎（脾腎陽虛證）的大鼠模型。方法將SD實驗大鼠按隨機數字表法隨機分為4組：正常對照組、脾腎陽虛組、潰瘍性結腸炎組（潰結組）、脾腎陽虛潰結組（病證結合組），正常對照組無任何干預措施；脾腎陽虛組先以番瀉葉灌胃，然后用冰水濕潤皮毛后再用電風扇將其皮毛吹干；潰結組以三硝基苯磺酸鈉（TNBS）灌腸；病證結合組先以脾腎陽虛組的方法處理，連續處理4周后，再予TNBS灌腸。觀察大鼠一般癥狀體征、中醫證候、結腸組織的改變、血清大鼠游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、大鼠游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等指標。結果病證結合組、脾腎陽虛組大鼠的中醫證候評分、血清FT3、FT4、SOD、MDA等指標與正常對照組、潰結組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；病證結合組、潰結組結腸肉眼觀及結腸黏膜損傷程度與正常對照組、脾腎陽虛組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論先以番瀉葉灌胃及冰水濕身風干法處理大鼠，再用TNBS灌腸，從而研制出的潰瘍性結腸炎（脾腎陽虛證）大鼠模型，對臨床有實踐意義。

潰瘍性結腸炎 脾腎陽虛證 病證結合 動物模型 大鼠

潰瘍性結腸炎（UC）的病因尚不十分清楚，在我國發病率逐年增高［1］。為了更好地闡明該病的病因病機、發展規律及理想的防治，建立理想的動物模型具有重要的意義。筆者在近10年的臨床研究中發現，大多UC患者臨床表現以脾腎陽虛的癥狀為主，目前臨床上對于潰瘍性結腸炎動物模型的研究多種多樣，但未見有契合脾腎陽虛證的動物模型。為此，本研究前期進行了脾腎陽虛證潰結大鼠的研制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雌雄各半SD大鼠40只，體質量（200±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 試劑與儀器 大鼠游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、大鼠游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）測定試劑盒，購于上海通蔚生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒購于北京博邁斯科技發展有限公司。全自動圖像數字化分析儀、微循環顯微鏡（上海徠卡顯微鏡公司生產，湖南中醫藥大學第二附屬醫院病理科及皮膚病研究實驗室提供）。

1.3 動物分組 選用健康成年SD雌雄各半大白鼠40只，隨機數字表法隨機分為4組：正常對照組、脾腎陽虛組、潰瘍性結腸炎組（潰結組）、脾腎陽虛潰結組（病證結合組），每組各10只。

1.4 模型制備 正常對照組無任何干預措施。潰結組：參照文獻［2-3］，使用三硝基苯磺酸（TNBS）誘導法：將大鼠禁食12 h，10%水合氯醛以4 mL/kg進行腹腔注射，后將一長約12 cm直徑2 mm的橡膠輸液管用石蠟油潤滑后緩慢插入肛門深約8 cm，將0.5 mL的三硝基苯磺酸乙醇溶液以100 mg/kg的比例注入肛管，造成潰結模型，3周后采集標本觀察。脾腎陽虛組參考文獻［4-5］，用自制的濃度為100%的番瀉葉藥液給大鼠灌胃，每日1次，每只3 mL，30 min后向每只大鼠均勻噴灑60 mL 3℃的冰水，將全身皮毛打濕，然后再把大鼠置于1400r/min的電風扇前將其毛發吹干，連續處理4周。癥證結合組綜合潰結組和脾腎陽虛組的方法，即先以100%番瀉葉灌胃，冰水噴濕全身皮毛后再用電風扇吹干，連續處理4周后，再予TNBS灌腸，3周后采集標本觀察。

1.5 標本采集與處理 1）于造模后稱大鼠體質量，脫頸椎全部處死，自距肛門約2 cm處向上剖取結腸8 cm左右，將取出結腸組織剖開、展平，肉眼觀察結腸黏膜形態，并做組織損傷評分比較。2）用10%烏拉坦將大鼠麻醉，置于實驗臺，分離大鼠頸動脈，插管并結扎，松開血管夾，采集管采集血液，將采集管放入離心機，3500 r/min離心15 min，取上清液放置于4℃冰箱，檢測FT3、FT4、SOD、MDA等生化指標。

1.6 觀察指標 1）觀察大鼠中醫證候的變化。中醫證候診斷標準參照 《中藥新藥臨床研究指導原則 （試行）》［6］及參考文獻［7-8］擬定。主證：大便溏泄；食少。兼證：體質量減輕甚則消瘦；精神萎靡，毛色無光澤；蜷縮扎堆；容易疲勞。具備2項主癥及兼癥中2項即可認為符合中醫證候診斷。2）疾病活動指數（DAI）。每日記錄大鼠的糞便性狀、便血情況、體質量、體溫等情況，進行疾病活動指數（DAI）［9-10］評分。3）結腸黏膜損傷指數（CMDI）。大鼠剖腹后立即進行肉眼大體結腸黏膜，用放大鏡觀察腸黏膜有無充血水腫、糜爛及潰瘍形成［12-13］，進行結腸黏膜損傷指數（CMDI）評分［14-15］。4）血清FT3、FT4、SOD、MDA等指標。FT3、FT4使用放免法檢測；SOD、MDA使用分光光度計法檢測。

表1 疾病活動指數（DAI）的評估指標

表2 肉眼觀察結腸形態和黏膜損傷評分標準

1.7 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件處理。計量資料以（±s）表示，先進行正態性檢驗，先進行正態性檢驗，符合正態性用t檢驗，不符合正態性用非參數（秩和）檢驗；計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠中醫證候比較 正常對照組：第1～3周大鼠精神狀態良好，反應敏銳，毛色光亮有澤，每1周體質量增加約40 g，大便硬。潰結組：第1～3周大鼠體質量稍有減輕，由180～220 g下降到160～200 g，無消瘦，稀便甚或膿血便，進食可，神態尚可，毛色稍無華，無蜷縮聚堆，活動尚靈敏，本組不具備2項主證及2項兼證，不符合中醫證候診斷標準。脾腎陽虛組：第1～3周逐漸出現大便溏泄，食少，蜷縮聚堆，易疲勞癥狀，體質量無明顯變化，具有主證2項及兼證2項，符合中醫證候診斷標準。病證結合組：灌腸后第1日出現懶動，厭食，稀便，第1～3周逐漸出現蜷縮聚堆，體質量減輕，由180～220 g下降到155～195 g，消瘦，神態萎靡，毛色暗淡無華，解稀便膿血便，與所有主證及兼證一致，符合中醫證候診斷標準。

2.2 各組疾病活動指數（DAI）評分比較 每天記錄大鼠大便性狀、便血、體質量、體溫等一般臨床表現，進行疾病活動指數（DAI）評分。通過體質量下降、糞便性狀、便血積分及體溫對各組進行比較，結果見表3，各組3項積分與正常對照組相比，差異均具有統計學意義（P＜0．05）；潰結組與病證結合組比較，體質量下降、大便性質、便血積分差異均無統計學意義（P＞0．05）。體溫方面，正常對照組與潰結組、脾腎陽虛組與病證結合組之間，差異無統計學意義（P＞0．05），后兩組大鼠體溫均顯著低于前兩組（P＜0．05），提示番瀉葉苦寒瀉下，極易損失體內陽氣，再以冰水噴施皮毛和吹風處理，對機體陽氣更易損傷。

表3 各組大鼠DAI比較（±s）

表3 各組大鼠DAI比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與病證結合組比較，△P＜0.05；與脾腎陽虛組比較，▲P＜0.05。下同。

組別 n 體質量下降（分） 體溫（℃）大便性狀（分） 便血（分）正常對照組 1 0潰結組 1 0脾腎陽虛組 1 0 3 6 . 4 1 ± 0 . 9 6△1 . 9 8 ± 0 . 1 9*▲3 6 . 2 7 ± 0 . 8 3△0 . 1 2 ± 0 . 1 6*3 5 . 1 3 ± 0 . 7 7*0 0 0 3 . 8 9 ± 0 . 2 3*▲3 . 1 2 ± 0 . 1 8*▲2 . 6 7 ± 0 . 2 4*0病證結合組 1 0 2 . 0 6 ± 0 . 2 0*▲3 4 . 9 8 ± 0 . 6 9*4 . 0 5 ± 0 . 1 9*▲3 . 0 7 ± 0 . 2 2*▲

2.3 各組結腸黏膜損傷指數（CMDI）比較 見表4。造模完成后，結腸黏膜肉眼大體觀察，正常對照組大鼠腸黏膜皺襞血管紋理清晰，沒有明顯的糜爛和潰瘍，整個腸段平均長度在18 cm以上；潰結組、病證結合組兩組大鼠可見不同程度的腸壁增厚粘連，糜爛和潰瘍表面附著有黑黃相兼樣物質，周圍黏膜充血水腫明顯，整個腸段長度縮短，平均長度在15 cm左右；脾腎陽虛組大鼠結腸黏膜見輕度充血，無炎癥及潰瘍形成。

表4 各組大鼠CMDI評分比較（分，±s）

表4 各組大鼠CMDI評分比較（分，±s）

組別 n 結腸形態 結腸黏膜正常對照組 1 0 0 0潰結組 1 0 1 . 4 9 ± 0 . 2 3*4 . 3 7 ± 0 . 3 1*脾腎陽虛組 1 0 0 . 0 5 ± 0 . 1 4 0 . 5 6 ± 0 . 2 4病證結合組 1 0 1 . 6 3 ± 0 . 1 9*4 . 5 2 ± 0 . 2 8*

2.4 各組大鼠血清FT3、FT4、SOD、MDA等檢測指標比較 見表5。FT3、FT4使用放免法檢測；SOD、MDA使用分光光度計法檢測。血清FT3、FT4：脾腎陽虛組和病證結合組均顯著低于正常對照組和潰結組 （P＜0.01）。血清SOD、MDA：正常對照組、潰結組血清SOD顯著高于脾腎陽虛組、病證結合組 （P＜0.01），血清MDA則顯著降低（P＜0.01）。

3 討 論

歷代醫家認為UC的發病，濕熱為其主要原因，但本課題組一直致力于中醫藥防治潰瘍性結腸炎的基礎與臨床研究，近10年的前期研究發現大多UC患者表現為脾腎陽虛的癥狀為主，實為病延日久，損傷腎陽，命門火衰，無力溫煦脾土，最終導致脾腎陽虛。已有研究者對潰瘍性結腸炎的動物模型進行過研究［16］，也有學者對脾腎陽虛證模型進行研究［5，17-18］，但將兩者結合起來的UC脾腎陽虛模型的制作方法尚未見相關報道，因此研制該病證動物模型對于加深對其病理本質的認識及開創新的治療方法顯得尤為重要。

表5 各組大鼠FT3、FT4、SOD、MDA比較（±s）

表5 各組大鼠FT3、FT4、SOD、MDA比較（±s）

與正常對照組、潰結組比較，**P＜0.01。

組別 n F T 3（f m o l / m L）F T 4（f m o l / m L） S O D（N U / m L）M D A（n m o l / m L）正常對照組 1 0潰結組 1 0脾腎陽虛組 1 0 8 . 7 6 ± 0 . 3 4 8 . 3 5 ± 0 . 4 6 6 . 0 6 ± 0 . 6 5*1 1 . 6 8 ± 0 . 2 2 1 7 6 . 3 6 ± 5 . 3 1 1 1 . 3 0 ± 0 . 5 6 1 7 4 . 1 2 ± 8 . 7 2 8 . 7 9 ± 0 . 3 5*1 5 9 . 3 2 ± 6 . 5 5*0 . 2 0 ± 0 . 0 5 0 . 2 2 ± 0 . 0 6 0 . 3 4 ± 0 . 0 4*病證結合組 1 0 5 . 9 0 ± 0 . 4 6*8 . 3 3 ± 0 . 6 8*1 5 7 . 4 4 ± 9 . 2 1*0 . 3 5 ± 0 . 0 9*

目前動物實驗中主要通過觀察動物的癥狀，結合《中醫虛證辨證參考標準》［7］，來判斷腎陽虛模型是否成功。腎陽虛模型常會出現毛發稀疏、暗淡無光澤，進食飲水減少，反應變慢，蜷縮扎堆，消瘦，畏寒、體溫下降，活動減少等癥狀。其他生化指標主要涉及下丘腦-垂體軸、甲狀腺、生殖系統、腎以及一些其他的血液指標、免疫功能等，如常伴有血清FT3、FT4含量明顯下降［19-20］，MDA含量增高、SOD降低［21-22］。脾陽虛證動物模型的表現大多與腎陽虛證相類似：體質量下降，體溫降低，食欲減退，倦怠乏力，嗜臥扎堆，大便溏泄，毛色無光，個別動物肛門脫垂，甚則死亡［23］；生化指標有：脾細胞膜蛋白激酶C（PKC）活性明顯降低、胞漿PKC活性明顯增高［24］，血清SOD活性降低［25］，MDA含量增高［26］，結合脾陽虛及腎陽虛癥狀及生化指標，可以得出脾腎陽虛證會有體溫下降，SOD活性降低，MDA含量增高。

從本實驗結果可以看出，脾腎陽虛組及病證結合組大鼠體溫、SOD活性顯著低于正常對照組及潰結組，血清MDA含量顯著升高，結果符合脾腎陽虛型會出現的癥狀及生化指標的變化。

綜上所述，番瀉葉灌胃及冰水濕身風干法造成的脾腎陽虛型大鼠，再用TNBS灌腸，從而研制出的脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠模型，對臨床有實踐意義。

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Experimental Research of Rat Model with Ulcerative Colitis of Spleen-kidney Yang Deficiency Type

WANG Yipei，ZHU Ying，WANG Xuan. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To investigate establishment of the rat model with ulcerative colitis of Spleen-kidney yang deficiency type based on ulcerative colitis model.Methods：A11 the SD rats were divided randomly into 4 groups，namely the normal control（NC），the Spleen-kidney Yang Deficiency（SKYD），the ulcerative colitis（UC），and the SKYD with ulcerative colitis（SKYDUC）.The rats in NC group had no intervention measures，in UC clystered by TNBS，in SKYD gavaged with folium sennae solution and washed with ice water，then dried their furs with electric fan，and in SKYDUC managed firstly with the same method as SKYD for four weeks，then clystered by TNBS.The following items were observed：the general symptoms and signs，the changes of syndrome of traditional Chinese medicine，colon tissue and serum indicators such as FT3，FT4，MDA，SOD.Results：Compared with the NC and UC group，the differences of the TCM syndrome score，serum FT3，FT4，SOD and MDA in the SKYDUC and SKYD group were statistically significant（P＜0.05）.Compared with the NC and SKYD group，the difference of eye view of colon and colonic mucosa damage in SKYDUC and UC group was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：The method used to induce the model in SKYDCB is feasible in practice.

Ulcerative colitis；Spleen-kidney Yang Deficiency；Combination of disease and syndrome；Animal model；Rats

R285.5

A

1004-745X（2015）08-1332-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.007

2015-03-20）

湖南省教育廳重點項目（13A069）；湖南省科技廳一般項目（2013SK3080）

△通信作者（電子郵箱：zhuying089＠126.com）