苦瓜甾醇對對乙酰氨基酚致小鼠肝損傷的保護作用

楊志剛，潘龍銀，王心睿

常熟理工學院生物工程系，常熟 215500

藥源性肝炎是一種在臨床實踐中嚴重威脅健康的常見病、多發病。由于肝臟首關效應的作用，一些藥物經長期或大量口服后，代謝物淤積在肝臟組織，就會損傷肝組織，引發肝炎。對乙酰氨基酚是臨床常用的解熱鎮痛藥，低劑量不至于損傷肝細胞，但大劑量或長期服用，則在肝內代謝過程中產生大量自由基堆積而引起肝細胞膜脂質過氧化，損傷細胞膜產生細胞毒性，致使炎癥發生，肝功能受損。

植物甾醇是一類以環戊烷全氫菲為骨架的天然醇類化合物，天然植物甾醇種類繁多，主要包括豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇4 種無甲基甾醇，廣泛存在于植物細胞與組織中，已被確認具有免疫調節、消炎退熱、降低血脂和膽固醇、減少動脈粥樣硬化損傷、清除自由基及護養皮膚等多種生理功效，廣泛應用于食品衛生行業，深受消費者的青睞［1-3］。

苦瓜甾醇對肝損傷影響的相關研究尚未見報道。本實驗觀察對肝損傷模型小鼠施加不同劑量苦瓜甾醇后的生理指標變化，探討苦瓜甾醇對小鼠肝損傷的保護作用及機理。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級ICR 健康雄性小鼠48 只，體重(25 ±3)g，南通大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(蘇)2014-001。

1.2 藥物與試劑

苦瓜甾醇提取物BMSE(按黃賢校等方法［4］實驗室制備，純度85.36%);對乙酰氨基酚(天津市健生制藥有限公司);谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、白蛋白(ALB)、考馬斯亮藍蛋白(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模

小鼠48 只，隨機分為6 組:正常對照組，模型對照組(濃度40 mg/mL，即4 g 對乙酰氨基酚溶于100 mL 生理鹽水中，腹腔注射10 mg/kg，現用現配)、陽性對照組(聯苯雙脂60 mg/kg)、苦瓜甾醇低劑量組(50 mg/kg)、中劑量(100 mg/kg)、高劑量(200 mg/kg)，每組8 只。本實驗用橄欖油作為溶劑來溶解聯苯雙酯和苦瓜甾醇。

1.3.2 給藥

正常對照組和模型對照組小鼠灌服10 mg/kg橄欖油，陽性對照組和苦瓜甾醇各劑量組分別按照劑量給予相應的藥物，每曰早、晚各給藥一次，連續給藥7 d，最后一次給藥后2 h 開始禁食，除正常對照組外其余各組一次性腹腔注射對乙酰氨基酚400 mg/kg［5］，正常對照組腹腔注射10 mg/kg 生理鹽水，禁食(自由飲水);24 h 后，各組經眼球后靜脈叢取血，測定血清中ALT、AST、ALB、TP 的含量;取肝臟，用4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重，計算肝臟系數(肝臟重量/體重)。取肝右葉相同部位0.2 g肝組織，以1.8 mL 4 ℃生理鹽水制成10%肝勻漿，3500 rpm 離心10 min，取上清液待測，測定各組肝組織SOD、MDA、GSH-PX。部分肝臟切片鏡檢，觀察肝臟損傷程度。

1.3.3 血清及肝組織生化指標檢測

摘除小鼠眼球取血，靜置，3000 rpm，離心15 min，按試劑盒說明測定血清中ALT、AST 活性及ALB、TP 含量;取出肝臟，用4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，取部分肝臟，剪碎后加入9 倍生理鹽水，在冰浴中用電動玻璃勻漿機制10%肝勻漿液，3000 rpm 離心15 min，取上清液，按試劑盒說明測定肝組織中SOD、GSH-PX 活性和MDA 含量。

1.4 統計學方法

實驗數據以“平均值±標準差”表示，應用統計軟件SPASS13.0 進行t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠血清中ALT、AST 活性及ALB、TP 含量的影響

結果見表1。肝損傷模型組小鼠血清中ALB、TP 水平與正常對照組比較，顯著降低(P＜0.01)，而ALT、AST 水平和肝臟系數與正常對照組比較顯著增加(P＜0.01)。苦瓜甾醇低劑量組小鼠與對肝損傷模型組比較，血清中ALB、TP 水平略有升高，ALT、AST 水平和肝臟系數略有降低，但未顯現統計學差異，而苦瓜甾醇中、高劑量組小鼠血清中ALB、TP 水平顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)，ALT、AST水平和肝臟系數顯著降低(P＜0.05 或P＜0.01)，且呈現良好的劑量依賴性。

2.2 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠肝組織中SOD、GSHPX 活性和MDA 含量的影響

結果見表2。與正常對照組比較，小鼠肝臟SOD、GSH-PX 活性在對乙酰氨基酚致肝損傷模型組顯著降低(P＜0.01)，而MDA 含量顯著增加(P＜0.01)。與對乙酰氨基酚致肝損傷模型組比較，苦瓜甾醇低劑量組小鼠肝臟組織中SOD、GSH-PX 活性升高，MDA 含量下降，但未顯現統計學差異，而苦瓜甾醇中、高劑量組小鼠肝臟組織中SOD、GSH-PX活性均顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)，MDA 含量顯著下降(P＜0.05 或P＜0.01)，且呈現良好的劑量依賴性。

表1 小鼠血清中ALT、AST 活性，TP、ALB 含量和肝臟指數(± s，n=8)Table 1 ALT，AST activity，TP，ALB content and liver index in mice liver (± s，n=8)

表1 小鼠血清中ALT、AST 活性，TP、ALB 含量和肝臟指數(± s，n=8)Table 1 ALT，AST activity，TP，ALB content and liver index in mice liver (± s，n=8)

注:與正常對照組相比，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜0.01;Compare with model，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

表2 小鼠肝臟組織中SOD、GSH-PX 活性，MDA 含量(±s，n=8)Table 2 SOD，GSH-PX activity and MDA content in mice liver(±s，n=8)

表2 小鼠肝臟組織中SOD、GSH-PX 活性，MDA 含量(±s，n=8)Table 2 SOD，GSH-PX activity and MDA content in mice liver(±s，n=8)

注:與正常對照組相比，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜0.01;Compare with model，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

2.3 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠肝組織的影響

實驗可見，正常對照組小鼠肝臟外觀呈現紅褐色，大小形態正常，表面被膜光滑，色澤紅潤，質軟而脆，鏡下結構清晰，未見明顯變性和壞死;模型對照組小鼠肝臟明顯腫大，彈性減弱，表面有點狀出血，鏡下呈現局灶性壞死癥狀;苦瓜甾醇各劑量組和陽性對照組可以減輕肝細胞損傷程度，顯著改善細胞變性和壞死，有效地保護肝臟，尤其是苦瓜甾醇高劑量組作用顯著，效果與陽性對照組相近;結果見表3、圖1。肝損傷程度分級:“-”:正常肝組織;“+”:肝細胞變性或點狀壞死;“++”:肝細胞變性或局灶性壞死;“+++”:肝小葉不到1/3 肝細胞壞死。

3 討論與結論

肝損傷的防治目前仍是一個全球性的嚴峻課題。通過建立實驗性肝損傷動物模型，篩選保肝藥物，探索保肝作用機制，具有重要的現實意義［6］。對乙酰氨基酚是解熱鎮痛藥，臨床上常作為阿司匹林的替代用藥，長期服用時或大劑量使用時可導致嚴重毒性效應。實驗中小鼠腹腔注射對乙酰氨基酚后，肝臟出現中毒性肝炎、肝壞死等病理現象，形成肝損傷模型［7，8］。苦瓜甾醇各劑量組小鼠肝臟系數減少，說明對乙酰氨基酚引起的肝臟炎癥反應受到了苦瓜甾醇的抑制，肝臟損傷程度減輕，肝臟腫大被緩解。

血清中ALT、AST 的含量是評價肝損傷的重要標志。當肝細胞受到損害時，細胞膜通透性改變，ALT、AST 釋放入血液，致使血清中ALT 和AST 的含量上升。灌服苦瓜甾醇組小鼠能保持血清ALT、AST 的較低水平狀態，表明灌服苦瓜甾醇在一定程度上緩減了對乙酰氨基酚對小鼠肝細胞膜的急性損傷。肝細胞內ALB、TP 具有抗氧化劑、損傷修復功能，在肝功能受損時合成與分泌減少［9］。本實驗中苦瓜甾醇中高劑量灌服組小鼠肝細胞ALB、TP 含量明顯高于模型組，表明苦瓜甾醇有助于ALB、TP 蛋白合成與分泌，有效預防肝組織遭受急性損傷引發細胞代謝紊亂。

表3 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠肝組織病理改變的影響(±s，n=8)Table 3 Pathological changes of tissue in mice liver (±s，n=8)

表3 苦瓜甾醇對肝損傷小鼠肝組織病理改變的影響(±s，n=8)Table 3 Pathological changes of tissue in mice liver (±s，n=8)

注:與正常組比較，##P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with control，##P ＜0.01;Compared with model，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

圖1 對照組(A)、模型組(B)、苦瓜甾醇高劑量組(C)、聯苯雙酯組(D)中小鼠肝組織病理變化(HE 染色，25 ×)Fig.1 Histopathological changes of rat liver from control group (A)，model group (B)，phytosterol group (high-dose)(C)and bifendate group (D)(HE staining，25 ×)

MDA 是膜脂過氧化產物，其濃度間接反映機體細胞膜系統受損程度;SOD 為超氧自由基清除因子，其含量可間接反映機體清除自由基的能力［10，11］。本實驗中苦瓜甾醇各劑量組小鼠相比較模型組，MDA 含量均有降低，SOD 活力均有提高，表明苦瓜甾醇有助于清除自由基，抑制脂質過氧化反應，防止細胞膜受損，遲滯細胞腫脹壞死，對對乙酰氨基酚所致肝損傷有顯著的保護作用。GSH-PX 是機體內廣泛存在的一種含硒抗氧化酶，可以清除由活性氧和羥自由基誘發的脂質過氧化物，以阻斷脂質過氧化連鎖反應，保護細胞膜結構和功能的完整性［12］。當對乙酰氨基酚攝入量過大時，其代謝產物量超過GSH 的清除能力，加劇膜脂質過氧化，引發肝損傷，苦瓜甾醇有助于保持GSH 活性和肝臟解毒能力，緩減肝臟受損程度。

綜上所述，苦瓜甾醇有助于緩減對乙酰氨基酚引發肝組織炎癥反應，維持體內SOD、GSH-PX 等酶活性，抑制脂質過氧化反應，防止細胞膜受損和細胞代謝紊亂，從而起到對急性肝損傷的保護作用，可能成為肝損傷預防與治療的候選輔助藥物。

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