香椿子石油醚提取物對大鼠糖尿病腎病的保護(hù)作用

李萬忠，王曉紅，韓瑋娜，劉冬梅

濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，濰坊 261053

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是多病因的代謝疾病，發(fā)病機(jī)制是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)［1］。目前對DN 防治尚無有效方法，化學(xué)藥雖對血糖、降壓、降脂、抗凝等有較好控制，但毒副作用相對較大。基于此，尋找安全、有效、來源豐富的天然產(chǎn)物對于DN 治療有重要意義。山東地區(qū)民間使用香椿子泡水或煎服，對DN 具有較好療效。香椿子有降糖、抗凝血、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用［2-6］，所以香椿子不失為一種有市場潛力的干預(yù)DN 物質(zhì)來源。本文研究香椿子石油醚提取物對DN 大鼠腎臟的保護(hù)作用，可為DN 臨床防治提供一定理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥物

香椿子，購自濟(jì)南圣科技術(shù)開發(fā)有限公司，經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室許崇梅博士鑒定為楝科香椿屬植物香椿Toona sinensis(A.Juss.)Roem.的果實(shí);香椿子石油醚提取物由濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 試劑

鏈脲佐菌素 STZ (Sigma 公司，批號031M1287V);檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);抗體購自Sigma-Aldrich 公司與Santa Cruz 公司。

1.3 設(shè)備

酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司);血糖儀(羅氏公司);全自動生化分析儀(日立公司):光學(xué)顯微鏡(Olympus公司);透射電鏡(TEM，日立H-7650)。

1.4 動物

健康清潔級雄性Wister 大鼠，體重(200 ±20)g，合格證號為SCXK 魯20130001，購于山東省魯抗醫(yī)藥動物實(shí)驗(yàn)中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組與給藥

180～200 g 雄性Wistar 大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)抽取10 只為正常組，普通飼料喂養(yǎng);造模大鼠25 只喂以高脂高糖飼料(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供)，4 周后STZ 60 mg/kg 造模，血糖介于16.7～25.0 mmol/L 者繼續(xù)喂養(yǎng)，尿蛋白超過20 μg/min，DN 模型成功建立;將DN 大鼠隨機(jī)分為模型組9 只、PEE 干預(yù)組11 只;PEE 干預(yù)組5 mg/100 g·d 連續(xù)灌胃10 周，其余兩組灌胃等量生理鹽水。

2.2 標(biāo)本收集

大鼠于末次給藥后單籠收集24 h 尿液，離心，4℃保存。大鼠于末次給藥后稱體重，水合氯醛按體重腹腔注射，麻醉后心臟取血，離心，留取血清-20℃保存?zhèn)溆?。心臟插管注入4 ℃生理鹽水灌洗至腎臟色白，摘取雙腎去掉包膜稱重，留取腎臟電鏡標(biāo)本，其余部分多聚甲醛固定待用。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 血、尿指標(biāo)

測定大鼠空腹血糖FBG、血肌酐Scr、尿肌酐Ucr、尿素氮BUN;試劑盒測定尿蛋白、HbAlc、血清T-AOC、SOD、MDA、GSH-PX、CAT 含量。

2.3.2 腎臟系數(shù)

腎臟系數(shù)=腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.3.3 腎臟病理指標(biāo)

取多聚甲醛固定樣本，石蠟包埋，常規(guī)切片，進(jìn)行HE、PAS、PASM、Masson 染色，光鏡觀察大鼠腎臟病理變化。

2.3.4 免疫組化檢測

運(yùn)用顯微鏡對每樣本免疫組化(TGF-β1、CTGF、collagen IV)選取放大400 倍5 個視野拍照，Isolutions 軟件對陽性結(jié)果定量分析，得出各組平均陽性強(qiáng)度。

2.3.5 腎臟電鏡觀察

取腎臟電鏡標(biāo)本，經(jīng)固定染色后，在透射電鏡下觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 香椿子石油醚提取物對DN 大鼠體重與血糖的影響

與正常組相比，模型組體重明顯減輕(P＜0.01);腎臟系數(shù)升高(P＜0.01);血糖明顯增加(P＜0.01)。與模型組相比，PEE 干預(yù)組體重明顯增加(P＜0.01);腎臟系數(shù)降低(P＜0.05);血糖明顯降低(P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠體重、腎臟指數(shù)及腎功相關(guān)參數(shù)Table 1 Body weight，index of renal hypertrophy and renal function-related parameters in different groups at the end of treatment

注:與正常組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01;與模型組比較，cP ＜0.05，dP ＜0.01。Note:compared with normal group，aP ＜0.05 andbP ＜0.01;compared with model group，cP ＜0.05 and dP ＜0.01.

3.2 香椿子石油醚提取物改善DN 大鼠的腎功能

與正常組相比，模型組大鼠的24 h 尿量、尿蛋白、HbAlc、BUN、Scr 顯著上升(P＜0.01);Ucr 明顯降低(P＜0.01)。與模型組相比，PEE 干預(yù)組的24 h 尿量、尿蛋白、HbAlc、BUN、Scr 大幅減少(P＜0.01或P＜0.05);Ucr 明顯提升(P＜0.01)，見表1。

3.3 香椿子石油醚提取物對DN 大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組大鼠的T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT 活性顯著降低(P＜0.01)，MDA 水平明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，PEE 干預(yù)組的T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT 活性增加P＜0.01 或P＜0.05)，MDA 水平明顯降低(P＜0.05)，見表2。

3.4 香椿子石油醚提取物改善STZ 糖尿病大鼠腎臟的病理損傷

HE、PAS、PASM、Masson 染色觀察各處理組腎臟的病理變化，對PAS、PASM、Masson 染色進(jìn)行定量分析計(jì)算腎小球硬化指數(shù)和腎小球纖維化面積百分比。正常組大鼠腎臟病理無明顯變化;與正常組相比，模型組大鼠腎小球肥大，鮑曼囊變窄，毛細(xì)血管管腔變窄，系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加，糖原沉積明顯增多，膠原沉積明顯增多;PEE 干預(yù)組大鼠腎臟上述病理損傷較STZ 組得到明顯改善(P＜0.05)，見圖1。

圖1 不同處理組大鼠對腎臟病理變化的影響Fig.1 Histopathological changes in the kidneys of DN rats with PEE treatment

表2 不同處理組大鼠對抗氧化指標(biāo)影響Table 2 Content of antioxidant indexes in experimental rats at the end of treatment

圖2 各組大鼠腎臟透射電鏡下結(jié)構(gòu)變化(×7000)Fig.2 Structural changes were observed in the kidneys of DN rats by TEM (×7000)

3.5 腎臟病理電鏡觀察

透射電鏡下正常組腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小球GBM均勻無增厚，上皮足突分布均勻;模型組大鼠腎臟組織部分GBM 增厚明顯，厚薄不均，呈駝峰狀，部分足突、次級突起融合明顯，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、裂孔減少明顯。干預(yù)組大鼠腎臟組織表現(xiàn)為節(jié)段性GBM 中等增厚，足突融合明顯，有不同程度改善，見圖2。

3.6 免疫組化檢測各組大鼠腎組織TGF-β1、CTGF、collagen IV 表達(dá)

氧化應(yīng)激可通過活化TGF-β1、CTGF、collagen IV 信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌以及細(xì)胞外基質(zhì)合成和沉積，導(dǎo)致腎小球硬化?？瞻捉MTGF-β1、CTGF、collagen IV 蛋白水平?jīng)]有明顯差異;與正常組相比，模型組腎臟組織內(nèi)TGF-β1、CTGF、collagen IV 蛋白水平顯著增高;與模型組DN 相比，PEE 干預(yù)組腎臟組織內(nèi)TGF-β1、CTGF、collagen IV 蛋白水平明顯降低(P＜0.05)，見圖3。

4 結(jié)論與討論

DN 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚不清楚。氧化應(yīng)激激活幾乎所有糖尿病并發(fā)癥相關(guān)病理通路，是DN發(fā)病機(jī)制的核心環(huán)節(jié)［7］，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激是重要的共同機(jī)制。氧化應(yīng)激在DN 發(fā)生發(fā)展中主要表現(xiàn)為腎系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞氧自由基生成增多，導(dǎo)致細(xì)胞受到損傷。PEE 提高SOD、CAT、GSH-Px 活性及總抗氧化力，探討氧化應(yīng)激在DN 發(fā)病機(jī)制中作用，可為DN 防治提供理論依據(jù)。

采用先喂高脂飼料，誘發(fā)胰島素抵抗，再行STZ注射，破壞胰島組織，產(chǎn)生糖尿病模型，與臨床2 型糖尿病發(fā)病相似;在此基礎(chǔ)上，又飼喂高熱量飲食，出現(xiàn)持續(xù)高血糖、蛋白尿等病理改變，成功建立大鼠DN 模型。

DN 大鼠早期病理改變?yōu)槟I小球肥大、腎小球現(xiàn)高壓、高灌注、高濾過、蛋白尿等表現(xiàn)。PEE 降低DN 大鼠24 h 尿量、尿蛋白、HbAlc、BUN、Scr 等，調(diào)整DN 大鼠糖代謝，減少尿蛋白排出［8］，有一定改善DN 大鼠腎功能作用。

TGF-β1 是重要的致纖維化因子［9］，CTGF 刺激成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、纖維化，兩者促進(jìn)腎成纖維細(xì)胞膠原生成，在DN 發(fā)生發(fā)展中有重要作用。Col IV 是糖尿病腎病重要標(biāo)志物之一［10］，水平高低對反映糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸有重要理論意義和應(yīng)用價值。PEE 對DN 大鼠腎臟具有保護(hù)作用，為香椿子防治DN 提供初步試驗(yàn)依據(jù)，至于具體物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖3 免疫組化比較不同組大鼠腎臟TGF-β1、CTGF、collagen IV 表達(dá)Fig.3 Expression of TGF-β1，CTGF and collagen IV in the kidneys of DN rats with PEE treatment

1 Kitada M，Kanasaki K，Koya D.Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease.World J Diabetes，2014，5:342-356.

2 Xing SS(邢莎莎)，Chen C(陳超).Studies on hypoglycemic effects of total polyphenols from the seeds ofToona sinensis.Pharmacol Clin Chin Mater Med(中藥藥理與臨床)，2011，27(3):42-44.

3 Xing SS(邢莎莎)，Chen C(陳超).Study on the antioxidation of polyphenols from the seeds ofToona sinensisJuss)Roemin vitro.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2010，38:7285-7287.

4 Rao YQ(饒婭琦)，Chen C(陳超)，Zhao B(趙博).Blood anticoagulation effects ofToona sinensisseed.J Sichuan TCM(四川中醫(yī))，2008，26(11):58-61.

5 Jin GL(金桂蘭)，Chen C(陳超).Antithrombotic effects ofToona sinensisseeds decoction.China Pharm(中國藥房)，2011，22:1364-1366.

6 Zhao Q(趙瓊)，Sun QY(孫黔云)，Yang QX(楊慶雄).Protective effects of a polyphenol from the seed ofToona sinensison activation and injury of endothelial cell induced by complement.Chin Pharm Bull(中 國 藥 理 學(xué) 通 報(bào))，2011，27:1041-1044.

7 Chen Y(陳洋)，F(xiàn)u T(付婷)，Jiang AH(姜愛花).Relationship between oxidative stress and diabetic nephropathy.J Mil Surg Southwest China(西南軍醫(yī))，2012，14:278-280.

8 Singh VP，Bali A，Singh N，et al.Advanced glycation end productsand diabetic complications.Korean J Physiol Pharmacol，2014，18:1-14.

9 Huang S(黃姍)，Cao WF(曹文富).The effect of JJFSN on the expression of TGF-β1 mRNA，Ⅳcollagen protein and HGF in the kidney of diabetic rats.J Fourth Mil Med Univ(第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào))，2009，30:1345.

10 Dronavalli S，Duka I，Bakris GL.The pathogenesis of diabetic nephropathy.Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008，4:444-452.