蜜楝花及果實中吳茱萸堿、吳茱萸次堿及內(nèi)酯含量積累變化研究

馬英麗，楊秋琛，尹陽陽，趙 樺

陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000

蜜楝(Evodia lenticellataHuang)為蕓香科吳茱萸屬植物，主要分布于我國陜西南部和四川等地［1，2］。該植物近成熟果實在民間可入藥，功效同吳茱萸果實。

吳茱萸生物堿是吳茱萸屬植物吳茱萸、石虎、疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實中的一類主要生物堿成分［3］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸生物堿類具有重要的藥用價值，具有抗腫瘤、保護心臟、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、調(diào)節(jié)血糖、減肥、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，對阿爾茨海默病作用治療也有一定的療效［4-8］，在臨床得到日益廣泛的應(yīng)用。

目前，對吳茱萸有效成分及其藥理作用的研究主要集中在吳茱萸、石虎、疏毛吳茱萸植物，對同屬植物蜜楝的研究尚不多見，本實驗室曾對蜜楝近成熟果實中脂肪酸和多糖成分做過研究報道，發(fā)現(xiàn)與吳茱萸果實相比，蜜楝果實中脂肪酸和多糖的含量及抗菌、抗氧化作用基本相同［9，10］。本文對陜西漢中產(chǎn)蜜楝不同生長階段的花、果實中吳茱萸、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯成分進行了分析研究，并與同地產(chǎn)吳茱萸花和果實中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿三種成分積累變化進行比較，以期了解蜜楝植物有效成分含量及其積累動態(tài)變化，以期為該植物資源的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

Waters e2695 高效液相色譜儀，2489 紫外檢測器，自動進樣器，柱溫箱，Empower 色譜工作站(美國Waters 公司);AB204-S 電子分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司);KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);UPH-IV-20T 優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(成都超純科技有限公司);SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 材料與試劑

蜜楝和吳茱萸花及果實于2014年6月至11月，采自陜西省漢中市漢臺區(qū)雷家巷，經(jīng)陜西理工學(xué)院楊培君教授鑒定為蕓香科吳茱萸屬植物蜜楝和吳茱萸。實驗材料取自同一生長地植株，每次在5～10 株基本相同的植株上不同部位隨機取樣，以保證不同時間所采實驗材料中有效成分含量變化對比的科學(xué)性。吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿標品購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司(批號分別為:15011423、14021835、14022444)。

乙腈、四氫呋喃、甲醇均為色譜純，其他試劑為分析純，水為自制超純水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

Waters e2695 高效液相色譜儀，Inertsil ODS-3C18色譜柱(4.6 ×150 mm，5 μm)，流動相乙腈-四氫呋喃-水混合溶液(41∶1∶58)，流速1.0 mL/min，檢測波長225 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.2 樣品溶液的制備

取蜜楝樣品，在55 ℃條件下烘干，粉碎過65 目篩。稱取約0.5 g，精密稱定，置于具塞100 mL 錐形瓶中，加45 mL 甲醇溶液，準確稱重。在超聲功率為120 W 超聲頻率為40 KHz，溫度為30 ℃條件下，超聲提取40 min，取出，放冷，稱重，用純甲醇溶液準確定容至50 mL 容量瓶，進樣前用0.45 μm 的濾膜過濾。同一生長時期實驗材料制備三個重復(fù)樣品供試液，每份樣品供試液分別進樣測定3 次。

2.3 標準品溶液的制備

精密稱取吳茱萸內(nèi)酯標準品9.93 mg，用甲醇定容于10 mL 容量瓶中，制成0.993 mg/mL 母液，稱取吳茱萸堿標準品11.10 mg，用甲醇定容于25 mL 容量瓶中，制成0.444 mg/mL 母液，稱取吳茱萸次堿標準品10.310 mg，用甲醇定容于25 mL 容量瓶中，制成0.412 mg/mL 母液，得相應(yīng)標準品儲備液備用。

準確量取吳茱萸內(nèi)酯標準品儲備液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，分別用甲醇溶液定容至10 mL 的棕色容量瓶中，配制成濃度分別為49.65、99.30、148.95、198.60、248.25 μg/mL 的吳茱萸內(nèi)酯標準品梯度溶液備用。

準確量取吳茱萸堿標準品儲備液0.5、1、2、3、4、5 mL，分別用甲醇溶液定容至25 mL 的棕色容量瓶中，配制成濃度分別為8.88、17.76、35.52、53.28、71.04、88.80 μg/mL 的吳茱萸堿標準品梯度溶液備用。

準確量取吳茱萸次堿標準品儲備液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，分別用甲醇溶液定容至25 mL 的棕色容量瓶中，配制成濃度分別為8.25、16.50、24.74、32.99、41.24、49.49 μg/mL 的吳茱萸次堿標準品梯度溶液備用。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

按照2.1 項下方法，分別測定2.3 項下三種標準品梯度溶液，每個濃度分別進樣三次，以標準品溶液濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線，分別得吳茱萸內(nèi)酯的回歸方程為Y吳茱萸內(nèi)酯=1955.4X-5577.3(R2=0.9996)，在49.65～248.25 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。吳茱萸堿的回歸方程為Y吳茱萸堿=89913X+73191 (R2=0.9990)，在8.88～88.80 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。吳茱萸次堿回歸方程為Y吳茱萸次堿=56127X-51856(R2=0.9990)，在8.25～49.49 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

分別取濃度為204.40 μg/mL 的吳茱萸內(nèi)酯母液3 mL，濃度為88.80 μg/mL 的吳茱萸堿母液3 mL，以及濃度為49.49 μg/mL 的吳茱萸次堿母液3 mL，三種母液均加入10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，可得吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿的混合標品，其中吳茱萸內(nèi)酯的濃度為61.32 μg/mL，吳茱萸堿的濃度為26.64 μg/mL，吳茱萸次堿的濃度為14.85 μg/mL。三種標品混合溶液的色譜圖見圖1 A。

3.2 精密度試驗

按照2.1 項下方法，分別用吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品溶液重復(fù)進樣5 次，每次進樣10 μL，吳茱萸內(nèi)酯峰面積的RSD為0.75%，吳茱萸堿峰面積的RSD為0.81%，吳茱萸次堿峰面積的RSD為1.15%，實驗表明儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性試驗

精密稱取同一蜜楝樣品6 份，每份約0.5 g，均精密稱定。按2.3 項下方法制備供試液，按2.1 項下條件測定，每份進樣3 次，每次進樣10 μL。吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為3.35%、1.17%和1.86%，說明本文實驗方法對蜜楝三種成分的測定均有很好的重現(xiàn)性。

3.4 穩(wěn)定性試驗

按2.3 項下方法用某一份蜜楝樣品制備供試液，供試液分別于提取后0、1、2、4、8、12、24、48 h 按照2.1 項下方法進樣測定，吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為4.23%、1.42%和3.07%，說明蜜楝樣品供試液中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 加樣回收率試驗

稱取同一蜜楝樣品6 份，每份0.2 g，精密稱定，向6 份樣品中分別加入3.9 mg 吳茱萸內(nèi)酯對照品;稱取同一蜜楝樣品6 份，每份0.5 g，精密稱定，向6份供試樣品中分別加入2.1 mg 吳茱萸堿對照品;稱取同一蜜楝樣品6 份，每份0.5 g，精密稱定，向6 份樣品中分別加入1.32 mg 吳茱萸次堿對照品，按2.3 項下方法制備供試液，按2.1 項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿加樣回收率實驗(n=6)Table 1 Spiked recovery of evodin，evodiamin and rutaecarpine (n=6)

3.6 樣品含量測定

3.6.1 蜜楝花及果實中三種成分含量測定

稱取不同發(fā)育階段的蜜楝花及果實共7 個樣品各3 份，每份0.5 g，精密稱定。按照2.3 項下方法制備供試液，按照2.1 項色譜條件下測定，每份樣品供試液進樣3 次，每次進樣10 μL。測得7 個發(fā)育時間段樣品中吳茱萸內(nèi)酯含量在4.63～27.39 mg/g 之間，吳茱萸堿含量在0.09～12.55 mg/g 之間，測得吳茱萸次堿含量在0.21～3.46 mg/g 之間。樣品含量測定色譜圖見圖1 B，不同發(fā)育階段吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿含量和RSD見表2。

表2 蜜楝、吳茱萸不同生長階段花與果實中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量測定結(jié)果(n=3)Table 2 Determination results of the content of evodin，evodiamin and rutaecarpine in different growth stages of E.lenticellata and E.rutaecarpa fruits and flowers (n=3)

3.6.2 吳茱萸花及果實中三種成分含量測定

稱取吳茱萸花、幼果及果實三個發(fā)育階段樣品各3 份，每份0.5 g，精密稱定。按照2.3 項下方法制備供試液，按照2.1 項色譜條件下測定，每份樣品供試液進樣3 次，每次進樣10 μL。測得吳茱萸花、幼果和近成熟果樣品中吳茱萸內(nèi)酯含量在11.77～14.32 mg/g 之間，吳茱萸堿含量在0.69～17.38 mg/g 之間，測得吳茱萸次堿含量在0.28～3.21 mg/g 之間。蜜楝、吳茱萸不同發(fā)育階段吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿含量和RSD見表2。

圖1 混合對照品(A)及蜜楝果實樣品(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A)and sample of E.lenticellata fruit (B)

4 結(jié)論與討論

HPLC 法測定不同植物中生物堿及內(nèi)酯含量時所用流動相不盡相同，多為乙腈、四氫呋喃及水混合溶液，三種溶液的比例有一定的變化［11］。本實驗用乙腈-四氫呋喃-水混合溶液作為流動相，對三種溶液的配比情況與吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿色譜峰的變化進行了考察分析，當將流動相比例調(diào)至41∶1∶58 時，三種成分的峰形以及與相鄰組分的分離度效果最好，基線平穩(wěn)。故本實驗使用的流動相最終確定為乙腈∶四氫呋喃∶水的比例為41∶1∶58。這可能是由于不同材料中所含成分不同而對生物堿及內(nèi)酯成分的影響不同所致。

實驗結(jié)果表明，隨著發(fā)育時間的推移，蜜楝花和果實中吳茱萸生物堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯的積累逐漸增加，在近成熟果實中三者的含量均達到最高，其中吳茱萸內(nèi)酯含量最高(2.74%)，吳茱萸堿次之(1.26%)，吳茱萸次堿較低(0.35%)，蜜楝果實中三種成分之間含量的差異與吳茱萸果實中三種成分含量分布的情況相同(表2)。當果實成熟果皮顏色變化時，三種成分的含量有所下降，這種情況與藥農(nóng)采摘蜜楝果實的時間基本相符。研究結(jié)果也表明，與吳茱萸相比，蜜楝花及果實中這三種成分的積累變化情況與吳茱萸的相似，相比之下蜜楝近成熟果實中吳茱萸內(nèi)酯的含量較吳茱萸中的豐富，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量較低于吳茱萸的含量。《中國藥典》(2010 版)規(guī)定，吳茱萸藥材中含吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總量不得少于0.15%，含吳茱萸內(nèi)酯(檸檬苦素)不得少于1.0%［12］。本研究結(jié)果表明蜜楝果實中所含吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總量為1.57%，吳茱萸內(nèi)酯含量為2.74%，遠高于《中國藥典》中對吳茱萸藥材的基本要求。因此，蜜楝近成熟果實可以作為吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯提取制備的一種植物資源，具有良好的開發(fā)利用價值。

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