組培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛多糖及乙醇溶出物動態積累規律研究

陳乃東，陳乃富，王陶陶，顧 鎮

1皖西學院生物與制藥工程學院;2 皖西中藥與天然藥物工程技術研究中心，六安 237012;3安徽醫科大學藥學院，合肥 230032

霍山石斛(Dendrobium huoshanenseTang et Cheng)屬蘭科石斛屬多年生草本植物，主產于安徽霍山縣，具養胃生津、滋陰清熱、明目等功效［1］，是安徽道地藥材之一，由于自然狀態下萌芽率低、生長緩慢，加上長期過度采挖，資源瀕危［2-5］。在霍山石斛的道地產區，采用組培快繁快速獲得試管苗或人工誘導種子萌發產生實生苗大規模野外栽培的組培霍山石斛，已逐漸替代野生資源成為藥用霍山石斛的主要來源［2-5］。多糖和乙醇溶出物是石斛類中藥發揮藥理作用的主要成分［6-8］，在2010 版《中國藥典》就以多糖含量和乙醇溶出物含量作為判斷鐵皮石斛質量標準［9-12］，因此，研究組培霍山石斛、野生霍山石斛多糖及乙醇溶出物的積累與株齡的關系，對于霍山石斛的規范化栽培和采收具有重要意義。實驗同時對當前藥材市場中霍山石斛的主要偽品——河南石斛(Dendrobium henanenseJ.L.Lu et L.X Gao)的多糖及醇溶物的動態積累進行了對比研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

TU-1901 雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);KQ-5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-S6 型數顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠);GL-200-Ⅱ型離心機(上海安亭科學儀器廠);GL-20G-Ⅱ電子分析天平(上海安亭科學儀器廠);202A-3型數顯電熱干燥箱(上海錦屏儀器儀表有限公司)。葡萄糖對照品(SIGMA 試劑公司);其他所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 供試樣品

供試藥材野生霍山石斛、河南石斛采于安徽省霍山縣，組培霍山石斛由安徽省霍山縣億康生物科技有限公司提供，品種和株齡經安徽省省級2011 協同創新中心——霍山石斛產業化開發協同創新中心主任陳乃富教授鑒定為1～4年株齡組培霍山石斛(tissue-culturedDendrobium huoshanense)、1～4年株齡野生霍山石斛(wildDendrobium huoshanense)、1～4年株齡河南石斛(Dendrobium henanense)。采集的樣品莖葉分離，莖80 ℃烘至恒重，粉碎，過60 目篩，干燥器儲存待用。供試樣品采集信息見表1。

表1 供試樣品采集信息Table 1 Information of the samples used in the experiments

2 實驗方法

2.1 乙醇浸出物及總多糖提取液的制備

精密稱取干燥至恒重的供試樣品粉末1.0 g 以95%乙醇(g∶mL，1∶25)85 ℃回流提取1 h，重復三次，過濾，合并濾液，得乙醇總浸出物溶液，加95%乙醇定容至75 mL，備用。

濾渣于90 ℃熱水(g∶mL，1∶100)浸提2 h，重復提取3 次，過濾，合并提取液，減壓濃縮至100 mL，4℃的冰箱冷卻1 h，5000 rpm 離心15 min，收集上清液，得總多糖提取液，定容至100 mL，備用。實驗設三次重復。

2.2 多糖的含量測定

精密吸取1.0 mL 步驟2.1 中制備的總多糖提取液，置于10 mL 具塞刻度試管，在冰水浴中緩緩精密加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，搖勻，冷卻后置沸水浴中保溫10 min 后取出，冰水浴中冷卻10 min，于621 nm 下測吸光度值(A)。以葡萄糖為對照品制標準曲線:精密稱取105 ℃干燥恒重的標準葡萄糖以蒸餾水配制0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液，精密量取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 和1.0 mL 葡萄糖標準溶液于具塞刻度試管中，分別加水定容至1.0 mL，搖勻，在冰水浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，搖勻，冷卻后管口加蓋，置沸水浴中保溫10.0 min 后取出，冰水浴中冷卻10.0 min，以葡萄糖標準溶液0.0 mL 管為空白，于621 nm 下測吸光度值，得回歸方程A=9.366C+0.101，R2=0.995，A 為吸光度，C 為濃度。計算出各供試樣品以葡萄糖計的多糖含量。

精密量取步驟2.1 中制備的總多糖提取液90 mL，緩緩加入無水乙醇至乙醇的濃度為76%，4 ℃冰箱中保存24 h 后5000 rpm 離心15 min，沉淀依次用乙醇，丙酮和乙醚反復洗滌數次，溶解在適量蒸餾水，按Sevag 法脫蛋白，冷凍干燥，得精制多糖，精密稱取精制多糖10.0 mg，置l00 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，精密吸取1.0 mL，按測定標準曲線的方法測定其吸光度，按下式計算換算因子(F):

其中:W:精制多糖質量(mg);C:多糖液中葡萄糖折合濃度(mg/mL);D:稀釋倍數。

測得葡萄糖對各供試樣品多糖的換算因子(表2)。各樣品以葡萄糖計多糖含量乘以葡萄糖對供試樣品多糖的換算因子，計算出供試樣品中多糖含量。

表2 葡萄糖對各供試樣品多糖的換算因子Table 2 The conversion factor of glucose to polysaccharides from different ages of tissue-cultured and wild D.huoshanese as well as D.henanense

2.3 醇溶性浸出物含量測定方法

精密量取制備的各供試樣品乙醇浸出液25 mL，置于干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重，計算供試品中乙醇浸出物含量。重復3次。

2.4 數據統計與分析

利用SPSS17.0 對所測數據進行單因素方差分析。

3 結果與分析

3.1 多糖積累規律

多糖作為能量物質同時參與植物營養貯藏與代謝，多糖的累積與藥用植物的生長是一個互相交替的過程，生長年限對多糖的累積有較大的影響。組培霍山石斛、野生霍山石斛、河南石斛多糖含量測定結果見表3。方差分析結果表明，不同株齡的組培霍山石斛、野生霍山石斛和河南石斛多糖含量測定結果有統計學意義(P≤0.05)。三種石斛多糖含量與生長年限密切相關，株齡2年的植株多糖含量最高，株齡4年的多糖含量最低，這與三種石斛樣品的生理特性有關:株齡1年的植株，莖葉均生長旺盛，莖、葉中的葉綠體均可進行光合作用，多糖積累的速度快，二年生的植株基本只能保留少量老葉，主要依賴莖中的葉綠體進行光合作用，仍有多糖積累，但積累速度下降，3～4年植株，完全無葉，莖逐漸老化，葉綠體減少，多糖的積累不足以維持植株維持生命活動的能量需要，需消耗前期合成的多糖維系生命活動。株齡相同的組培霍山石斛、野生霍山石斛和河南石斛多糖含量存在顯著差異，多糖的含量從大到小依次為:組培霍山石斛＞野生霍山石斛＞河南石斛，如以多糖含量作為標準，株齡2年的組培霍山石斛品質較好。

3.2 醇溶性浸出物累積規律

供試的3 種石斛醇溶性浸出物含量測定結果見表3。方差分析結果表明，實驗測定的12 種石斛樣品乙醇浸出物含量測定結果有統計學意義(P≤0.05)。栽培1～3年，三種石斛醇溶性浸出物含量均隨著生長期延長而增加，第4年出現下降，因此，從乙醇浸出物含量角度，三種石斛均以3年采收為宜。相同株齡的組培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛，野生霍山石斛醇浸出物量較高，但三者之間差別不明顯。

3.3 多糖和乙醇浸出物總量積累規律

三種石斛樣品多糖和乙醇浸出物總量與生長年限緊密相關(表3)，隨著生長周期的增加多糖和乙醇浸出物總量先增加后下降，組培霍山石斛在栽培第二年，多糖與醇浸出物總量達到最大，2年后多糖和醇溶性物質總量逐年下降，而野生米斛和河南石斛多糖與醇溶性組分總量在第三年達到峰值。組培霍山石斛與野生霍山石斛多糖與醇溶性組分總量差異不顯著，二者與河南石斛差別較為明顯。

表3 不同株齡的組培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛多糖和乙醇浸出物的積累規律(%，Mean±SD)Table 3 Accumulation of polysaccharides and ethanol-soluble extract in tissue-cultured and wild D.huoshanense and D.henanense(%，Mean±SD)

4 結論與討論

組培霍山石斛、野生霍山石斛與河南石斛多糖與醇溶性浸出物含量與生長年限密切相關。不同品種間多糖、浸出物含量存在顯著差異，但動態變化規律基本一致。根據多糖與浸出物含量的動態變化，如以多糖含量為采收目標，組培霍山石斛、野生霍山與河南石斛栽培2年采收為宜，如以乙醇浸出物含量為標準，三者均以生長三年的藥材品質為佳，這與傳統經驗認為三年株齡的霍山石斛品質最佳相一致。作為霍山石斛的主要偽品——河南石斛，從多糖含量到多糖與乙醇溶出物總量，明顯低于霍山石斛，因此，從多糖和以醇浸提物含量的角度考慮，河南石斛的藥材品質可能低于霍山石斛。

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