酶法聯合閃式提取紅葉李花多糖及單糖初步分析

衛 強，紀小影

安徽新華學院藥學院，合肥 230088

紅葉李［Prunus cerasiferaEhrh.cv.AtropurpureaJacg.］又名紫葉李或櫻桃李，是落葉喬木，為薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬(Prumus)植物，原產于亞洲，為我國最常用的城市景觀植物之一［1］。紅葉枝和葉呈褐紅，有光澤，花色粉紅，深紅色果實。以葉色聞名，在整個生長期葉色呈紫紅色，尤其春秋兩季葉色更艷，且具有較強的耐濕、耐寒力，為園林常用的彩葉樹種，極具觀賞價值［2，3］。現代研究表明，紅葉李枝葉中黃酮類成分含量豐富，以山奈酚較為突出［4］。紅葉李葉中紅色素可經80%乙醇提取得到，紅色素在酸性下穩定，而中性和堿性下不穩定，且不耐熱［5］。進一步研究紅葉李葉、枝不同方位和部位中花色素含量分布情況表明，朝南方葉、枝優于朝北方，葉中花青素含量優于枝條［6］。

植物多糖具有良好的降血糖、降血脂［7］、抗腫瘤［8］、免疫調節作用［9］和改善學習記憶能力［10］等，目前對紅葉李花中多糖的提取和單糖組成研究鮮有報道。植物細胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質等物質構成的致密結構，多糖成分與維生素、蛋白質、果膠、淀粉、植物纖維等成分共存，普通提取難以破壁溶解，提取率較低［11］。酶解作用可破壞細胞壁致密結構，使細胞壁組織水解，打開胞內成分溶出的屏障，解決多糖的溶出問題。閃式技術也具有高效破壁功能，酶法與閃式聯合使用可有效發揮破壁功能，大大提高對多糖的提取效能。本文對紅葉李花中多糖類成分進行酶法和閃式提取，以DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G-150 進行分離純化得到多糖的組分，對多糖組分進行乙酰化，以氣相色譜-質譜(GCMS)初步分析其單糖組成，可為其多糖進一步開發應用提供基礎。

1 材料與儀器

紅葉李花采自合肥大蜀山區，經安徽新華學院李啟照副教授鑒定為薔薇科植物紅葉李(Prunus cerasiferaEhrh.cv.AtropurpureaJacg.)的花。復合酶(其中纖維素酶5000 IU/g、酸性蛋白酶2000 IU/g、果膠酶2000 IU/g、木聚糖酶5000 IU/g，寧夏夏盛實業集團有限公司)。鼠李糖(批號:111668-200602)、阿拉伯糖(批號:111506-200001)、木糖(批號:111508-200404)、甘露糖(批號:140651-200602)、葡萄糖(批號:110833-201205)、半乳糖標準品(批號:100226-201105)(中國藥品生物制品鑒定院，含量均為98%以上)，其它試劑均為分析純，水為純化水。

JHBE-50 型閃式提取器(河南金鼎科技發展有限公司);LDZ4-1.2 型低速離心機(北京京立離心機有限公司);KJ-SY-150 超聲提取器(北京同德創業科技有限公司);CNWB-C 型微波萃取器(廣州萬程微波設備有限公司);UV-4802 型紫外-可見分光光度計(美國尤尼柯儀器有限公司);Agilent 6890-5973N 氣相色譜儀(美國安捷倫公司);FA1004 型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 提取方法

2.1.1 酶法聯合煮沸提取

精密稱取干燥紅葉李花粗粉5 g 兩份，一份置于于500 mL 具塞錐形瓶中，加入100 mL 蒸餾水浸泡12 h，再加入0.1%的植物復合酶35 ℃酶解2 h，再加入200 mL 蒸餾水煮沸提取2 h。另一份不加酶，直接加入300 mL 蒸餾水同前煮沸提取。

2.1.2 酶法聯合超聲提取

精密稱取干燥紅葉李花粗粉5 g 兩份，一份同2.1.1 酶解后，再加入200 mL 蒸餾水超聲提取30 min，超聲功率2 kW。另一份不加酶，直接加入300 mL 蒸餾水同前超聲提取。

2.1.3 酶法聯合微波提取

精密稱取干燥紅葉李花粗粉5 g 兩份，一份同2.1.1 酶解后，再加入200 mL 蒸餾水微波提取5 min，微波功率2 kW。另一份不加酶，直接加入300 mL 蒸餾水同前微波提取。

2.1.4 酶法聯合閃式提取

精密稱取干燥紅葉李花粗粉5 g 兩份，一份同2.1.1 酶解后，再加入200 mL 蒸餾水閃式提取3 min，功率2 kW。另一份不加酶，直接加入300 mL蒸餾水同前閃式提取。

上述提取方法均重復3 次，每次提取液均減壓回收至約100 mL，以石油醚萃取、Sevag 法除蛋白，取少量樣品過0.45 μm 濾膜，稀釋適當倍數按照2.2 項下測定多糖含量。

2.2 多糖含量測定

［12］，精密稱取20.56 mg 葡萄糖標準品，以蒸餾水定容于100 mL 容量瓶。精密移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL 葡萄糖標準品溶液，置于8 只10 mL 刻度試管中，分別加入蒸餾水至2 mL，再分別加入1.0 mL 的5%的苯酚溶液及7 mL 的濃硫酸溶液，搖勻，水浴加熱25 min，冷卻至室溫，以去離子水為空白對照，在490 nm 下測定吸光度，以吸光度A1為縱坐標，葡萄糖濃度C1為橫坐標，繪制標準曲線A1=0.0036C1-0.0024，線性范圍為0～16.45 μg/mL，測定樣品總糖得率。

分別精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL 葡萄糖標準品溶液，置于10 mL 刻度試管中，分別加入蒸餾水定容至4 mL，再分別加入5 mL濃度為6.5 mg/mL 的二硝基水楊酸(DNS)溶液，搖勻，沸水浴中加熱5 min，冷卻至室溫，蒸餾水定容至10 mL，于540 nm 波長下測定吸光度，以吸光度A2為縱坐標，葡萄糖濃度C2為橫坐標，繪制標準曲線A2=0.0049C2-0.0042，線性范圍為0～16.45 μg/mL，測定樣品還原糖得率。多糖得率計算公式為:

2.3 單因素實驗

因酶解與提取為兩個不同的處理過程，涉及因素多，為了簡化實驗流程，將單因素實驗分成單因素實驗一和單因素實驗二分別考察。

2.3.1 單因素實驗一

設定閃式提取因素(提取時間2 min，液料比20倍，轉速2000 rpm)，當酶解2 h 和酶用量0.10%時，研究酶解溫度(15、25、35、45、55、60 ℃)的多糖得率;當酶解溫度35 ℃和酶用量0.10%時，研究酶解時間(0.5、1、2、3、4、5 h)的多糖得率;當酶解溫度35 ℃和酶解時間3 h 時，研究酶用量(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3%)的多糖得率。

2.3.2 單因素實驗二

設定酶解因素(酶解溫度45 ℃、酶解時間2 h，酶加入量0.17%)，當液料比20 倍，轉速2000 rpm時，研究提取時間(1、2、3、4、5、6 min)的多糖得率;當提取時間4 min，轉速2000 rpm 時，研究不同液料比(10，20，30，40，50，60 倍)的多糖得率;當提取時間4 min，液料比40 倍時，考察不同轉速(1000、2000、3000、4000、5000、6000 rpm)的多糖得率。

2.4 響應面分析

以Design-Expert 8.0.6 統計軟件進行Box-Behnken 中心組合實驗設計和分析。見表1。

表1 酶法提取響應面因素及水平Table 1 Factors and levels of the enzymatic extraction of polysaccharides

2.5 多糖的單糖組分分析

將紅葉李花提取總多糖以蒸餾水溶解配制成濃度為120 mg/mL 的溶液，離心后取上清液1 mL 上DEAE-52 纖維素柱(1.5 cm ×60 cm)，以蒸餾水及0.1、0.2、0.4、0.6 mol/L 氯化鈉溶液依次洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集量為3 mL，于490 nm 處以苯酚-硫酸測定吸光度，繪制洗脫曲線。洗脫液濃縮，再經透析、濃縮、干燥，得紅葉李花粗多糖(簡稱PCS)。多糖溶解于5 mL 蒸餾水中，離心得上清液過Sephadex G-150 凝膠柱，用蒸餾水進行洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤測吸光值，繪制洗脫曲線，按照洗脫峰收集合并組分，透析冷凍干燥得精多糖Ⅰ(簡稱PPCS-Ⅰ)和精多糖Ⅱ(簡稱PPCS-Ⅱ)。

衍生化處理:稱取精多糖Ⅰ、精多糖Ⅱ和等量的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖標準品分別加入蒸餾水溶解，加入硼氫化鈉還原3 h，以冰乙酸調pH 4～5，加入甲醇，濃縮至干。加入醋酐，90 ℃下水浴1.5 h，冷卻，加入甲苯3 mL，N2吹干，加入乙醇，反復吹干3 次后，2 mL 三氯甲烷萃取，過濾得乙酰化產物。

GC-MS 條件:氣相色譜配毛細管管柱(HP-5，30×0.32 mm ×0.25 μm);氮氣，流速1 mL/min。進樣量1 μL;程序升溫:柱初始溫度160 ℃，以6 ℃/min升至200 ℃，保持6 min;進樣口和檢測器溫度均為250℃。質譜條件:EI 電離源，電離電壓70 eV;離子源溫度250 ℃;掃描范圍:m/z 30～600;分流比:30∶1。

3 結果與分析

3.1 提取方法

由表2 可知，酶處理前煮沸法、超聲、微波和閃式提取的平均提取率為5.14 ±0.75%，加酶后平均提取率提高至7.20 ±0.52%，可見酶處理對多糖得率有較大貢獻。從酶處理和提取方式的結合角度考慮，酶法聯合閃式提取多糖得率最高，提取率達到7.98%。

表2 不同提取方法提取多糖的比較(± s，n=3)Table 2 Comparison of different extraction methods(± s，n=3)

表2 不同提取方法提取多糖的比較(± s，n=3)Table 2 Comparison of different extraction methods(± s，n=3)

3.2 單因素實驗

圖1 酶解溫度(a)、酶解時間(b)、酶用量(c)、提取時間(d)、料液比(e)及轉速(f)對多糖得率的影響Fig.1 Effects of enzymatic temperature (a)，enzymatic time (b)，enzyme dosage (c)，extraction time (d)，liquid-solid ratio (e)and speed of revolution (f)on polysaccharides yield

結果見圖1(a～f)。由圖1a 可知，隨著酶解溫度的提高，多糖得率逐步提高，但溫度高于45 ℃，可導致酶解迅速，性能下降，故酶解溫度在35～45 ℃為宜。圖1b 顯示，酶解2～3 h 有利于發揮最佳酶解效果。圖1c 顯示，隨著酶用量加大，多糖得率逐步提高，酶用量＞0.20%時多糖得率幾乎不變，以0.15%～0.20%為宜。圖1d 顯示，隨著提取時間的增加，多糖得率逐步提高，但提取時間＞4 min 時多糖得率反而略有下降，這可能與瞬間產生的熱能對成分影響有關。圖1e 顯示，隨著液料比倍數的增加，多糖得率顯著增加，以30～40 倍為宜。圖1f 顯示，隨著轉速的增加，多糖得率持續增加，但轉速＞4000 rpm 時增加緩慢，考慮到能耗因素，以3000～4000 rpm 較合適。

3.3 響應面分析

3.3.1 酶法響應面設計與結果

在單因素實驗基礎上，選擇酶解溫度、酶解時間和酶加入量三個因素進行Box-Behnken 中心實驗設計，實驗結果見表2、3、4 和圖2(a～c)。

表3 酶法響應面分析設計及實驗結果Table 3 Design and results of response surface methodology of the enzymatic extraction

表4 酶法回歸分析結果Table 4 The results of variance analysis of the enzymatic extraction

由表4 可知，A、B、C三個因素，AB、AC、BC交互因素和B2、C2二次響應面模型效果極顯著(P＜0.01)，表明三個因素及其交互作用對紅葉李花多糖得率均有顯著影響。由圖2a 可知，酶解時間在2 min 和酶解溫度在35 ℃時多糖得率較低，隨著時間的延長，溫度的提高，多糖得率逐步提高。但提取時間過長，溫度過高反而會降低多糖得率。由圖2b 可知，隨著酶用量加大和酶解時間延長，多糖得率呈現平穩增長，又平穩下降的趨勢，表明兩者交互作用相對較弱。由圖2c 可知，隨著酶用量增加和酶解溫度提高，多糖得率呈現大幅度增加，后又明顯下降，提示兩者交互作用明顯。說明酶用量需要與溫度協調，達到酶解細胞壁的臨界點，同時不致水解多糖結構，才能提高提取效果。

對模型進行優化，得回歸方程為:

優化后模型R2=0.9993，失擬向檢驗(lack offit)P值為0.8785，不顯著，表明模型充分擬合。以軟件Expert-design 8.0 預測酶法最佳工藝為:酶解溫度為45 ℃，酶解時間為2 h，酶用量為0.17%。

圖2 酶解時間和酶解溫度(a)、酶用量和酶解時間(b)、酶用量和酶解溫度(c)、液料比和提取時間(d)、轉速和提取時間(e)及轉速和液料比(f)對多糖得率影響的響應曲面圖Fig.2 Response surface plots showing mutual effects of enzymatic time and enzymatic temperature (a)，enzyme dosage and enzymatic time (b)，enzyme dosage and enzymatic temperature (c)，liquid-solid ratio and extraction time (d)，speed of revolution and extraction time (e)as well as speed of revolution and liquid-solid ratio (f)

3.3.2 閃式提取響應面設計與結果

選擇3.3.1 最佳工藝優化結果進行酶解。同時在單因素實驗基礎上，選擇提取時間、液料比和轉速三個因素進行Box-Behnken 中心實驗設計，實驗結果見表5～7 和圖2(d～f)。

表5 閃式提取響應面因素及水平Table 5 Factors and levels of the smashing tissue extraction

表6 閃式提取響應面分析設計及實驗結果Table 6 Design and results of response surface methodology of smashing tissue extraction

表7 閃式提取回歸分析結果Table 7 The results of variance analysis of the smashing tissue extraction

由表7 可知，X、XY、YZ、X2、Y2、Z2對多糖得率影響極顯著(P＜0.01)由圖2d 和2e 可知，提取時間在3～4 min 內多糖得率呈現快速增加，快速降低的趨勢，而液料比在30～40 倍和轉速在3000～4000 rpm 范圍內曲面較平直，對多糖提取影響較小。說明在所選的液料比和轉速范圍內均可顯著提升對多糖的提取，而提取時間不宜過長。由圖2f 分析可知，隨著液料比倍數和轉速的增加，多糖得率平穩增加，且兩個因素對多糖提取影響相近，交互作用顯著。

對模型進行優化，得回歸方程為:

優化后模型R2=0.9995，失擬向檢驗P值為0.9805，不顯著，表明模型充分擬合。以軟件Expert-design 8.0 預測酶法最佳工藝為:提取時間為3 min，液料比35 倍，轉速為3000 rpm。

3.3.3 驗證性實驗

對實驗模型進行分析，得出紅葉李花多糖提取最優工藝參數為:酶解溫度為45 ℃，酶解時間為2 h，酶用量為0.17%，閃式提取時間為3 min，液料比35 倍，轉速為3000 rpm。多糖得率理論值為13.10%。以上述條件進行工藝驗證實驗，測得多糖得率實際值為13.02%(n=3，RSD=1.01%)，與理論預測值相比，相對偏差較小，說明工藝穩定。

3.4 多糖的單糖組分分析

如圖3a 所示，紅葉李花多糖經DEAE-52 柱層析，得到兩個峰，表明多糖由兩種不同組成的組分構成。如圖3b 和3c，利用SephadexG-150 層析柱對組分進一步分離純化，均出現單一狹窄的對稱峰，得到PPCS-I 和PPCS-II 兩種多糖組分純品。

圖3 DEAE-52 纖維素柱洗脫(a)、Sephadex G-150 洗脫得PPCS-Ⅰ(b)及Sephadex G-150 洗脫得PPCS-Ⅱ(c)的洗脫曲線Fig.3 Elution curves of DEAE-52 cellulose column chromatography (a)，PPCS-Ⅰby Sephadex G-150 (b)and PPCS-Ⅱby Sephadex G-150 (c)

由圖4a 對照可知，圖4b 顯示PPCS-I 由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖構成，摩爾比為12.11∶3.16∶7.06∶1∶4.92，圖4c 顯示PPCS-II 由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為5.02∶1∶13.65∶11.76∶8.39。

圖4 單糖標準品(a)、PPCS-I(b)及PPCS-II(c)的GC-MS 總離子圖Fig.4 GC-MS total ion chromatograms of standard monosaccharide (a)，PPCS-I (b)and PPCS-II (c)

4 結論

多糖分子量大，結構復雜，且與蛋白質、鞣質等大分子共存，提取難度大。采用酶法與閃式聯合提取方法，既可以達到快速破壁的效果，又避免了高溫對糖鏈和結構的破壞。其最佳工藝條件為:酶解溫度為45 ℃，酶解時間為2 h，酶用量為0.17%，閃式提取時間為3 min，液料比35 倍，轉速為3000 rpm。多糖實際得率達到13.02%。由DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G-150 分離純化，對PPCS-I 和PPCS-II純品進行GC-MS 分析，得到其單糖組成和比例分別為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖(12.11∶3.16∶7.06∶1∶4.92)，鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖(5.02∶1∶13.65∶11.76∶8.39)。本文為紅葉李花中多糖的進一步研究和開發提供了基礎。

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