五味子對H2O2誘導的HaCaT 細胞氧化應激損傷的保護作用

金銀萍，侯 微，高 薇，王玉帥，焉 石，王英平

中國農業(yè)科學院特產研究所，長春 130112

皮膚是維持人體生命和健康的重要部分，直接與外界接觸，是機體的第一道屏障，極易受到環(huán)境因素的影響而導致損傷。人類皮膚的衰老是機體衰老最易觀察到的外部顯示，是整體衰老的局部表現。促使皮膚衰老的因素很多，除了先天與遺傳因素外，還受外界環(huán)境中諸多因素的直接影響如污染、陽光、紫外線的照射、應激反應等。隨著社會人口老齡化和生活環(huán)境的不斷惡化，以及人們生活水平的提升，預防和延緩皮膚衰老越來越受到人們的重視。在“回歸自然、崇尚天然”的潮流趨勢下，以植物來源的天然功能性化妝品，備受消費者的青睞。

五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.是木蘭科(Magnoliaceae)五味子屬Schisandra多年生落葉藤本植物［1］。近年來有關五味子藥理活性的研究表明，五味子提取物及其所含的木脂素、多糖類等成分，均具有抗氧化活性［2-10］。但是，五味子對皮膚衰老方面的研究報道相對較少［11-13］。本試驗通過H2O2造成HaCaT 細胞(人皮膚角質形成細胞)自由基氧化損傷衰老模型，觀察五味子各組分抗皮膚細胞衰老效果，以期篩選得到五味子抗衰老護膚活性功能因子，為北五味子抗皮膚衰老產品的開發(fā)奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

HaCaT 細胞購自上海川翔生物科技發(fā)展有限公司;五味子醇甲(批號110857)、五味子酯甲(批號111529)、五味子甲素(批號110764)、五味子乙素(批號110765)購自中國藥品生物制品檢定研究所，五味子醇乙(批號YY90208)購自上海源葉生物科技有限公司;RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Gibco;胎牛血清購自Clack;胰蛋白酶購自HyClone;噻唑藍(MTT)、DPPH 購自Sigma;微量丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒購自南京建成生物工程研究所;總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS 法)購自碧云天生物技術研究所;30% H2O2購自天津市百世化工有限公司。

五味子果實采自吉林市左家鎮(zhèn)中國農業(yè)科學院特產研究所藥用植物資源圃，經中國農業(yè)科學院特產研究所艾軍研究員鑒定為木蘭科(Magnoliaceae)五味子屬Schisandra五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.四年生果實。

1.2 儀器與設備

ST-360 酶標儀(上海科華實驗系統有限公司);IBE1000 倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司);KDC-40 低速離心機(安徽中科中佳);HF151UV 二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司);FDU-2100 冷凍干燥機(日本EYELA);10AvP 高效液相色譜儀(日本SHIMADZU)。

2 實驗方法

2.1 HPLC 分析五味子各組分木脂素含量

2.1.1 樣品制備

五味子果實提取物(SC)，上大孔吸附樹脂AB-8，靜置過夜，依次用H2O、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫，每個梯度沖洗5 個保留體積，分別收集各梯度洗脫液，過濾，減壓濃縮，濃縮液經冷凍至干，備用。樣品組分依次命名為SC-0、SC-10、SC-30、SC-50、SC-70、SC-95。

2.1.2 色譜條件

Hypersil ODS2(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動相:乙腈(A)，水(B)。梯度洗脫模式:0～30 min，45%～75% A;30～35 min，75%～99% A;35～40 min，99%～45%;40～45 min，45%A;流速1 mL/min;檢測波長254 nm，進樣量10 μL，柱溫為室溫。

2.1.3 樣品測定

準確稱取五味子各組分樣品適量，按“2.1.2”條件進行測定，以下列公式計算五味子醇甲等5 種木脂素的含量(mg/g):木脂素的含量=(C×D)/W式中:C 為測試液中各木脂素濃度(g/L)，D 為供試液的稀釋因子，W 為樣品的質量(g)。

2.2 DPPH 法測定五味子各組分抗氧化能力

精密稱取DPPH 5.0 mg，用乙醇溶解并定容至100 mL 棕色容量瓶內，避光保存?zhèn)溆谩悠啡芤号渲瞥刹煌|量濃度梯度的待測液，混勻，備用。吸取待測樣品溶液0.1 mL 及3.9 mL 的DPPH 溶液，加入到5.0 mL 具塞試管中，搖勻，室溫避光放置90 min，取200 μL 加入96 孔酶標板中，于517 nm 處測定吸光值AbS1，每次重復3 次。根據下列公式計算樣品自由基清除率，清除率(%)=［(AbS0-AbS1)/AbS0］×100，AbS0為空白對照0.1 mL 溶劑與3.9 mL DPPH 混合溶液的吸光值。清除DPPH 的能力用IC50值表示［14］。

2.3 ABTS 法測定五味子各組分總抗氧化能力

精密吸取待測樣品10 μL 置96 孔酶標板上，加入工作液。空白溶液吸取50%乙醇10 μL，加入工作液，采用酶標儀在734 nm 進行測定。記錄吸光值，代入回歸方程計算［15］。

2.4 HaCaT 細胞培養(yǎng)

取HaCaT 細胞在含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的HaCaT 細胞，以1 ×105個/mL細胞接種到96 孔細胞培養(yǎng)板內，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 備用。

2.5 細胞增殖檢測

實驗分為空白組、模型組、藥物處理組和藥物預處理后加H2O2組，每組至少3 個復孔。空白組給予完全培養(yǎng)基;模型組加入終濃度為1000 μmol/L H2O2的完全培養(yǎng)基，作用時間1 h;藥物處理組根據各組分的實際情況分為4 個不同劑量組，預處理作用時間24 h;藥物預處理后加H2O2組是加入受試藥物作用24 h 后，加入終濃度為1000 μmol/L H2O2的完全培養(yǎng)基作用1 h。利用MTT 法判斷各組細胞增殖情況。加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h 后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO 溶解沉淀物，振蕩器混勻后，用酶標儀在490 nm 波長下檢測OD 值。細胞存活率通過以下公式計算:細胞存活率(%)=(OD處理/OD空白)×100%［13］。

2.6 五味子組分對氧化損傷HaCaT 細胞MDA、SOD 和GSH 水平的影響

取空白對照組、H2O2損傷組、不同劑量活性組分處理組的HaCaT 細胞(處理方式同前)，按照MDA、SOD 和GSH 檢測試劑盒說明書進行操作。

2.7 統計學分析

廣東省未來煤電發(fā)展主要受限于煤炭消費總量控制和環(huán)保容量約束。煤電行業(yè)污染物排放總量按照比2015年下降50%考慮，通過實施煤電機組超低排放改造，經測算，廣東環(huán)保空間可支撐煤電裝機約110 GW。按照等煤量控制測算，當電煤比例提高至75%時，廣東省可支撐煤電裝機約80 GW；當電煤比例提高至80%時，廣東省可支撐煤電裝機約85 GW。

3 實驗結果

3.1 HPLC 分析五味子組分木脂素含量

五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素是五味子中5 種主要的木脂素。按上述色譜條件進行測定，計算其在各組分中的含量。從表1 結果可以得出，木脂素含量的大小順序為:SC-70 ＞SC-50 ＞SC-95 ＞SC-30。SC-0 和SC-10 不含木脂素類成分。

表1 五味子各組分中木脂素含量(n=3， ± s)Table 1 Lignan contents of S.chinensis fractions (n=3，± s)

表1 五味子各組分中木脂素含量(n=3， ± s)Table 1 Lignan contents of S.chinensis fractions (n=3，± s)

3.2 五味子各組分清除DPPH 自由基能力的測定

五味子各組分清除DPPH 自由基能力的大小順序依次為:VC(0.17) ＞ SC-50 (1.08) ＞ SC-30(1.06)＞SC-95 (20.64)＞SC-70 (27.18)＞SC-10 (33.43)＞SC-0。SC-0 在38.00 mg/mL 時其清除率只為7%，受樣品溶解度的限制，無法進一步加大樣品濃度，且沒有實際意義，所以沒有求得具體IC50值。

五味子總提取物SC 經大孔樹脂分離純化所得的各組分，與SC 相比均具有極顯著性差異(P＜0.01);除SC-30 和SC-50 外，SC 和其余組分與陽性對照(Vc)比較，均具有極顯著性差異(P＜0.01)，DPPH 自由基清除能力均低于Vc。

SC-30 和SC-50 的抗氧化能力明顯強于其它組分，且清除DPPH 自由基能力相當，與SC 及其它組分段相比較具有極顯著性差異(P＜0.01)。

3.3 ABTS 法測定五味子各組分總抗氧化能力

結果顯示，五味子各組分總抗氧化能力的大小順序 為:SC-50 (5.127) ＞ VC(1.000)＞SC-30(0.765)＞ SC-70 (0.476)＞ SC-95 (0.058)＞SC-10 (0.012)＞SC-0。SC-0 其TEAC 值無限接近于0，沒有抗氧化活性;SC-50 的抗氧化能力與其它組分相比，具有極顯著性差異(P＜0.01)，且效果強于VC。

3.4 細胞增殖檢測

3.4.1 不同濃度五味子組分對細胞生長的影響

采用MTT 法檢測不同濃度五味子各組分對HaCaT 細胞生長得到影響。結果顯示，SC-0 和SC-10 在＜1000 μg/mL 時，除SC-10 在1000 μg/mL 時有細胞毒性之外，均不影響細胞的增殖;而其他組分在＞500 μg/mL 時，均對細胞產生明顯的細胞毒性，減少細胞增殖在23%～97%左右;SC-50 在100～250 μg/mL 之間時，對細胞有明顯的增殖作用，細胞活力提高12%～18%左右，與正常對照組比較具有極顯著差異。具體如圖1 所示。

圖1 五味子各組分對細胞生長的影響(n=6，± s)Fig.1 Effects of different fractions of S.chinensis on cell viability (n=6，± s)

3.4.2 五味子各組分對H2O2誘導細胞損傷的保護作用

根據篩選得到的五味子各組分的安全劑量范圍，設定4 個不同劑量組，預處理時間為24 h，利用MTT 法判斷各組細胞增值情況。結果顯示，SC-0 在100～200 μg/mL、SC-30 在1～10 μg/mL 之間時，對H2O2誘導的細胞損傷具有一定的保護作用，但是與模型組比較差異無統計學意義(P＜0.05);SC-10、SC-70 及SC-95 在安全劑量范圍內，對細胞活力無明顯變化;SC-50 處理組的細胞存活率較H2O2處理組明顯提高(P＜0.05，P＜0.01)，且呈劑量依賴性，但伴隨濃度增加到一定程度，逐漸出現細胞凋亡甚至死亡，存活率開始下降。具體如圖2 所示。

3.5 五味子組分對氧化損傷HaCaT 細胞MDA、SOD 和GSH 水平的影響

圖2 五味子各組分對H2O2誘導HaCaT 細胞損傷的保護作用(n=6，± s)Fig.2 Protective effects of different fractions of S.chinensis against H2O2-induced oxidative stress injury in HaCaT cells (n=6，± s)

用1000 μmol/L H2O2處理HaCaT 細胞與空白相比，脂質氧化產物MDA 增加21%左右，抗氧化酶SOD 降低64%左右，GSH 降低49%左右;而用測試組分處理之后，明顯降低了MDA 的生成，提高細胞內SOD 以及GSH 的活力(P＜0.01)。150 μg/mL SC-50 能有效減少MDA 生成量在37%左右，有效增加SOD 量在2.7 倍左右，增加GSH 量在1.8 倍左右。具體見表2。

表2 SC-50 組分對HaCaT 細胞中MDA、SOD 和GSH 水平的影響(n=3， ± s)Table 2 Effects of SC-50 on cellular MDA，SOD and GSH in HaCaT cells (n=3，± s)

表2 SC-50 組分對HaCaT 細胞中MDA、SOD 和GSH 水平的影響(n=3， ± s)Table 2 Effects of SC-50 on cellular MDA，SOD and GSH in HaCaT cells (n=3，± s)

注:與H2O2處理組比較，+P ＜0.05;≠P ＜0.01。Note:Compared with H2O2treated control，+P ＜0.05;≠P ＜0.01.

4 討論

中藥“組分結構”理論認為，中藥復方中各活性成分之間存在著一定的比例關系，組成物質基礎的最基本單元為單體成分，具有穩(wěn)定的結構;由同一化學類別的單體成分按照一定的比例構成組分，組分中各單體成分之間存在配伍配比關系;不同類別的組分按照一定的配伍比例組合構成中藥復方的整體性物質基礎［16］。因而本文以功能單位“組分”為基礎進行五味子抗皮膚衰老方面的研究。

越來越多的研究表明，自由基可以從細胞水平、分子水平乃至組織器官水平上對機體造成各種不可逆性的氧化性損傷，加速生物體細胞乃至整個機體的衰老進程，誘發(fā)各種與衰老相關的各種疾病［17-19］。人體細胞各種來源的大量自由基當中，最引人關注、研究較多的是ROS。ROS 包括及HO2·、·OH 等。H2O2是細胞內一種重要的氧自由基，對人體皮膚細胞能造成直接的氧化應激反應和氧化應激所致的氧化性損傷。在體外利用H2O2能夠誘導細胞并加速細胞因氧化應激所致的衰老進程，模擬體內氧化損傷的病理過程。

以DPPH 自由基清除能力和總抗氧化能力(ABTS 法)為考察指標，對五味子各組分的自由基清除能力進行評價，利用MTT 法篩選五味子各組分對H2O2誘導的HaCaT 細胞氧化應激損傷的保護作用，結果顯示，50%乙醇洗脫組分有較強的自由基清除能力，并顯著減少MDA 的生成，提高SOD 和GSH酶活性，這可能也是其對H2O2誘導的HaCaT 細胞損傷具有保護作用的重要機制之一。

在前人文獻報道指出，聯苯環(huán)辛烯類木脂素的抗氧化活性較好，本文檢測分析的五味子甲素、乙素等5 種主要木脂素均報道具有抗氧化的活性。從木脂素含量分布來看，50%乙醇組分不是木脂素含量最高的組分，但是抗氧化活性最強的組分。這也使我們對中藥“組分結構”理論有了進一步的理解和深思，進而開展進一步的試驗研究。

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