章魚胺及其衍生物的抗氧化性研究

曲映紅，劉志東，陳舜勝

1上海海洋大學，上海 201306;2 中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090

關于章魚胺的生物活性，文獻報道多為肥胖癥的治療和II 型糖尿病防治方面的研究［1，2］。既往研究發現章魚胺的前體化合物酪胺具有較的抗氧化活性，且與其濃度呈正相關［3］。本研究以章魚胺為原料合成了十種章魚胺衍生物，測定了它們的抗氧化活性，并與酪胺相對比，以期對章魚胺的生物活性做進一步研究。

許多研究證實，氧化與人類的許多疾病諸如老化、動脈硬化、癌癥等的發病機理有關，如自由基引發的氧化現象是機體衰老的主要原因。適當攝入具有抗氧化活性的物質可以抑制機體的自由基損傷，切斷過氧化鏈式反應，抵御和防治相關疾病，延緩衰老，保持健康［4］。

在評價一種物質的抗氧化活性時常采用測定其清除自由基能力的方法。同一種具有抗氧化活性的物質以不同的自由基為底物時，得到的結果往往會有所差別。若要全面評價一種物質的抗氧化性能，至少需要使用兩種方法，以驗證其活性的高低。利用對DPPH 自由基的清除效果來評價物質的抗氧化能力，是普遍采用的一種簡便快速的方法。超氧陰離子自由基作為自由基鏈式反應的引發劑，是機體內壽命最長的自由基;羥基自由基是毒性最大、最活潑的自由基，反應速率極快，是已知自由基中對人體危害最大的［5］。綜上所述，本研究通過考察對以上三種自由基的清除能力來評價章魚胺及其衍生物的抗氧化活性。

1 材料與儀器

1.1 試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma 公司);2-甲基苯甲酸、4-甲基苯甲酸、3-羧基吡啶、苯甲酸、4-硝基苯甲酸、2，3-二甲氧基苯甲酸、正十一烷基酸、2-硝基-3-甲基苯甲酸、2，6-二甲氧基苯酸、3，5-二甲氧基苯甲酸(上述10 種物質合稱取代酸);章魚胺，酪胺，N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，二甲基甲酰胺(DMF)，三乙胺，乙酸乙酯，氯化鈉，無水硫酸鎂，石油醚，鄰苯三酚，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，鹽酸，雙氧水(H2O2)，水楊酸，FeSO4，乙醇，甲醇(分析純，上海化學試劑采購供應站)。

1.2 儀器

Bruker INOVA 400 NMR 核磁共振儀，Waters LCT Premier TM XE 高效液相色譜-Alliance 2695 Quattro micro 質譜聯用儀，島津UV-1601PC 分光光度計，攪拌器，抽濾機等。

2 方法

2.1 章魚胺衍生物的通用制備方法

將0.4 g(2.1 mmol)章魚胺，2.2 mmol 取代酸，0.32 g(2.1 mmol)HOBt·H2O，0.52 g(2.73 mmol)的EDC·HCl 投入8 mL 干燥的DMF 中，加入0.87 mL 三乙胺，充氮氣保護，于室溫攪拌過夜，薄層(TLC)掃描法監測原料章魚胺反應完全。加入10 mL 水和30 mL 乙酸乙酯，攪拌后分出乙酸乙酯層，水層再用乙酸乙酯萃取(30 mL × 2)，合并乙酸乙酯層，用飽和氯化鈉溶液洗滌(20 mL)，無水硫酸鎂干燥1 h，過濾，蒸干濾液，得到油狀物，加入5 mL 乙酸乙酯、5 mL 石油醚和0.2 mL 甲醇，室溫攪拌2 h，析出白色固體，抽濾，濾餅用少量乙酸乙酯洗滌后抽干，經真空干燥得白色固體。

2.2 章魚胺、酪胺及章魚胺衍生物的抗氧化活性測定

2.2.1 DPPH 自由基清除能力的測定［6，7］

分別配制酪胺、章魚胺及章魚胺衍生物的5 mmol/L 甲醇溶液，同時配制濃度為0.5 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液。將4 mL 樣品溶液和1 mL DPPH溶液加入具塞試管中，搖勻，37 ℃避光放置30 min，在517 nm 測定其吸光度A1;將4 mL 樣品溶液和1 mL 甲醇按上法操作測定其吸光度A2;將4 mL 甲醇和1 mL DPPH 溶液按上法操作測定其吸光度A0。樣品對DPPH 自由基的清除率K(%)根據下列公式計算:

2.2.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定［8］

清除超氧陰離子自由基能力的測定采用鄰苯三酚自氧化法。鄰苯三酚在弱堿性環境中發生氧化分解產生的超氧陰離子自由基，隨著反應的進行不斷在體系中積累，從而使反應液在325 nm 處的吸光度發生變化。取50 mmol/L 的Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液4.6 mL 于試管中，25 ℃水浴中保溫15 min，加入樣品溶液1 mL，10 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻于25 ℃恒溫水浴中反應4 min，立即加入8 mol/L 的鹽酸1.0 mL 終止反應，以Tris-HCl 緩沖液調零點，325 nm 下測其吸光值，即A1。空白對照組(A0)用甲醇1 mL 代替樣品溶液，樣品對照組(A2)用甲醇0.4 mL 代替鄰苯三酚溶液。

清除率計算公式:

2.2.3 羥基自由基清除能力的測定［9］

清除羥基自由基活性的測定利用H2O2與Fe2+混合反應產生羥基自由基，在體系內加入水楊酸捕捉羥基自由基并產生有色物質，該物質在510 nm 波長處有最大吸收。反應體系中依次加入樣品溶液4 mL、9 mmol/L 的FeSO41 mL、9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加入1 mL 8.8 mmol/L 的H2O2啟動反應，37 ℃水浴中保溫反應30 min，測定510 nm 波長處的吸光度(A1)。將體系中的樣品溶液改為加入4 mL 甲醇，其他試劑不變，測得空白對照吸光度(A0);當向體系中加入1 mL 甲醇代替1 mL H2O2時，測得樣品對照吸光度(A2)。

清除率計算公式:

3 結果與分析

3.1 章魚胺衍生物的制備

共制備得到10 種章魚胺衍生物，如表1 所示。

表1 章魚胺衍生物Table 1 Octopamine derivatives

3.2 抗氧化活性分析

3.2.1 DPPH 自由基清除能力

章魚胺、酪胺及十種章魚胺衍生物的DPPH 清除率如圖1 所示。可以看出，這些物質清除DPPH自由基的能力差別較大，經顯著性分析發現，章魚胺、OA07、OA08 的DPPH 自由基清除能力明顯高于酪胺，且差異顯著(P＜0.01);OA02、OA04、OA05 的DPPH 自由基清除能力明顯低于酪胺，且差異顯著(P＜0.01);OA01、OA03、OA06、OA09、OA10 與酪胺的DPPH 自由基清除能力無顯著性差異。

3.2.2 超氧陰離子自由基清除能力

圖1 章魚胺、酪胺及章魚胺衍生物的DPPH 自由基清除率Fig.1 Scavenging rate of octopamine，tyramine and octopamine derivatives against DPPH free radicals

章魚胺、酪胺及十種章魚胺衍生物的超氧陰離子自由基清除率如圖2 所示。可以看出，這些物質清除超氧陰離子自由基的能力差別較大，經顯著性分析發現，章魚胺、OA05、OA07、OA08 的超氧陰離子自由基清除能力明顯高于酪胺，且差異顯著(P＜0.01);OA01、OA02、OA03、OA04、OA06、OA09、OA10 的超氧陰離子自由基清除能力明顯低于酪胺，且差異顯著(P＜0.01)。

圖2 章魚胺、酪胺及章魚胺衍生物的超氧陰離子自由基清除率Fig.2 Scavenging rate of octopamine，tyramine and octopamine derivatives against superoxide anion radicals

圖3 章魚胺、酪胺及章魚胺衍生物的羥基自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of octopamine，tyramine and octopamine derivatives against hydroxyl free radicals

3.2.3 羥基自由基清除能力

章魚胺、酪胺及十種章魚胺衍生物的羥基自由基清除率如圖3 所示。可以看出，這些物質清除羥基自由基的能力差別較大，經顯著性分析發現，章魚胺、OA01、OA02、OA03、OA04、OA06、OA07、OA08、OA09、OA10 的羥基自由基清除能力明顯高于酪胺，且差異顯著(P＜0.01);OA05 與酪胺的羥基自由基清除能力無顯著差異。

4 結論

本研究合成了章魚胺的10 種衍生物，比較了章魚胺、酪胺及10 種章魚胺衍生物的抗氧化活性。結果表明，章魚胺及其兩種衍生物OA07、OA08 對于DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力均高于章魚胺的前體化合物酪胺，且有顯著性差異(P＜0.01)。另一章魚胺衍生物OA05 具有很高的超氧陰離子自由基清除能力，但它對DPPH 自由基和羥基自由基的清除能力較弱。前人研究中用β-胡蘿卜素-亞油酸漂白法測定了酪胺清除過氧化自由基的能力，指出酪胺具有顯著抗氧化作用，且與其濃度呈正相關。本研究發現，酪胺雖然對DPPH 自由基和超氧陰離子自由基有一定的清除能力，但其清除羥基自由基的能力很弱。

以往研究中較多地提及章魚胺在減肥和治療Ⅱ型糖尿病方面的利用價值，本文中關于章魚胺及其衍生物抗氧化活性的研究將為進一步探索章魚胺的生物活性提供一定的理論基礎和研究依據。

1 Arch JRS.β3-Adrenoceptor agonists:potential，pitfalls and progress.Eur J Pharmacol，2002，440:99.

2 Pan CY(潘長玉).Diabetes(糖尿病學).Beijing:People’s Medical Publishing House，2007.208-222.

3 Yen GC，Kao HH.Antioxidative effect of biogenic amine on the peroxidation of linoleic acid.Biosci Biotech Biochem，1993，57:115-116.

4 Tang PC(唐鵬程)，Jiao SR(焦士蓉)，Tang YM(唐遠謀)，et al.Comparison and study on the antioxidant activity of pomegranate peel extract.Food Res Dev(食品研究與開發)，2012，33:12-15.

5 Zhou SS(周昇昇).Advances and comparison on antioxidant capacity in vitro evaluation methods.Hyg Res(衛生研究)，2010，39:164-167.

6 Gou MY(勾明玥)，Liu L(劉梁)，Zhang CZ(張春枝).Determination of antioxidant activity in 26 plants by DPPH method.Food Ferment Ind(食品與發酵工業)，2010，36:148-150.

7 Fang M(方敏)，Wang YF(王耀峰)，Gong ZY(宮智勇).Study on antioxidant activities of fifty kinds of fruits and thirty-three kinds of vegetables.Food Sci(食品科學)，2008，29:97-100.

8 Wang DC(王德才)，Gao LJ(高麗君)，Gao YX(高艷霞).Antioxidative effects of polysaccharide from Radix Angelicae dahurica in vitro.Lishizhen Med Mat Med Res(時珍國醫國藥)，2009，20:173-174.

9 Mo ZC(莫正昌)，Deng J(鄧靖)，Ji GQ(汲廣泉)，et al.Evaluation of in vitro antioxidant activities of extracts from Pyrola corbieri.Food Sci(食品科學)，2010，31:19-21.