板栗花純露的抗氧化活性研究

邵明輝，王雪青*，宋文軍，趙國強，付慶偉

1天津市食品與生物技術重點實驗室 天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134;2唐山遷西縣板栗產業研究發展中心，唐山 064300

紫外線輻射能引起皮膚變黑、紅斑和光敏等急性反應或導致皮膚干燥、起皺失去彈性和色素沉著等慢性反應，甚至有可能誘發皮膚癌［1］，由紫外線輻射引起的皮膚氧化是導致皮膚損傷、老化的重要原因［2，3］。因此，在陽光充足的夏季，護膚產品的抗氧化和防紫外線功能顯得越來越重要。目前在醫療、食品和化妝品領域廣泛應用的多為化學合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)等。研究發現，長期使用合成抗氧化劑，對生物體有潛在的毒副作用［4］。因此，開發以天然植物成分為主的抗氧化產品是近年來的研究熱點。

板栗花為殼斗科(Fagceae)栗屬植物栗(Castanea mollissima Blume)的雄性花序，香氣怡人、柔和、開闊，形狀為圓柱狀葇荑花序［5］。近年來，伴隨著板栗種植面積的不斷增加，其副產物板栗花的產量也十分可觀，但大多被當作廢物丟棄或燃料燃燒，造成資源的極大浪費。據報道，板栗花中含有豐富的活性物質，不僅具有顯著的抗氧化作用［6］，而且還有比較明顯的驅蚊效果［7］。目前，針對板栗花抗氧化性研究主要集中在黃酮類化合物上，其揮發性成分的抗氧化性研究甚少。因此，本研究選取提取板栗花精油過程中產生的副產物純露為研究對象，研究其抗氧化性并與夏季常用的花露水產品作對比，為板栗花的天然抗氧化性研究提供理論依據，為開發抗氧化新型花露水提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗花純露，由河北省唐山市遷西縣板栗研究發展中心提供(在蒸汽壓力為0.04 MPa，液固比為6，蒸餾2.5 h 條件下制得)。板栗花純露通過復蒸的方式經油水分離器得揮發油，約占板栗花純露的0.0621%，所獲得的板栗花精油為淺黃色油狀液體，具有濃郁的板栗花的特殊香氣。揮發油經GC-MS分析，鑒定出19 種化合物，占揮發油總量的98.21%，其中主要成分為α-甲基苯甲醇(11.88%)、芳樟醇(9.46%)、壬醛(11.73%)、松油醇(5.42%)、棕櫚酸(10.69%)和9，12-十八碳二烯酸(8.01%)等;隆力奇驅蚊花露水，其主要成分為乙醇、二乙基甲苯甲酰胺(5%)、二苯酮-4、三乙醇胺、蛇膽提取物、CI42090 等;六神驅蚊花露水，其主要成分為乙醇、丁基乙酰氨基丙酸乙酯(4.5%)、薄荷醇、EDTA 二鈉、蛇膽提取物、CI42090 等，均購于當地超市;DPPH，Sigma 公司;實驗所用其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

Alpha-1500 型紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司;722N 型可見分光光度計，北京晶弘精密儀器有限公司;ZK-82A 型真空干燥箱，天津遠方實驗儀器廠;KQ2200B 型超聲波清洗機，南京市超聲儀器有限公司;Perkin Elmer UV/VIS，Spectrometer Lambda 25。

1.3 實驗方法

1.3.1 板栗花純露清除DPPH 自由基能力的測定［8，9］

將板栗花純露稀釋成不同濃度的溶液，同樣將六神、隆力奇花露水和Vc 稀釋成相同濃度作為樣品溶液。分別向一系列10 mL 比色管中加入3.5 mL 用乙醇稀釋濃度為1.0 ×10-4mol/L 的DPPH 溶液和0.5 mL 樣品液，搖勻，避光反應30 min，以乙醇作為參比，測定517 nm 下的吸光度A，同樣方法測定3.5 mL 無水乙醇和0.5 mL 樣品液混合后在517 nm 下的吸光度A0，再測定3.5 mL DPPH 溶液和0.5 mL 無水乙醇混合后在517 nm 下的吸光度A1，平行測定三次，取平均值，并按以下公式計算不同濃度的樣品液對DPPH 自由基的清除率。利用不同濃度樣品溶液的清除率繪制曲線圖，由曲線擬合回歸方程計算DPPH 自由基清除率為50%時所需板栗花純露濃度，記為IC50，以IC50值表示板栗花純露清除DPPH 自由基能力。

1.3.2 板栗花純露還原能力的測定［10］

分別配制不同濃度的板栗花純露，同樣方法配制相同濃度的Vc 溶液、隆力奇和六神樣品液作為對陽性照組。分別加入0.2 mol/L 的磷酸緩沖液2 mL，質量分數為1%的鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］溶液2 mL，混合均勻，50 ℃水浴下保溫20 min，再加入質量分數為10%的三氯乙酸(TCA)溶液2 mL，震蕩混勻后離心。取離心后的上清液2 mL，加入2 mL 去離子水和0.4 mL 質量分數為0.1% 的氯化鐵(FeC13)溶液，震蕩混勻后在50 ℃水浴下保溫10 min，體系溶液由黃色變為藍色，在700 nm 下測定吸光度，進行比色。以去離子水代替樣品作為空白對照。平行測定三次，取平均值。

1.3.3 板栗花純露清除羥基自由基能力的測定［11］

以板栗花純露作為樣品液，配制好的Vc 溶液、隆力奇和六神樣品液作為對陽性對照組。在一系列10 mL 比色管中分別加入0.3 mL 濃度為0.4 mmol/L 的結晶紫溶液、1.2 mL 濃度為1.0 mmol/L 的硫酸亞鐵(FeSO4)溶液和0.6 mL 濃度為2.0 mmol/L 過氧化氫(H2O2)溶液，用pH=4.0 的磷酸檸檬酸緩沖溶液將上述溶液定容至10 mL，搖勻后靜置30 min，在580 nm 處，測其吸光度Ab，同時測定以上體系加過氧化氫之前，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的樣品液后體系在580 nm 處的吸光度Ax，測定不加過氧化氫前體系在580 nm 處的吸光度A0。平行測定三次，取平均值。按以下公式計算清除率。

1.3.4 板栗花純露對亞硝酸鹽清除率的測定［12］

取已知濃度的板栗花純露2 mL 于25 mL 容量瓶中，加入0.005 mg/mL 的亞硝酸鈉(NaNO2)標準溶液3 mL，加入pH=3.0 的磷酸檸檬酸緩沖溶液5 mL，37 ℃下反應30 min，立即加入2 mL 質量濃度為0.4%的對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后，加入1 mL 質量濃度為0.2%的鹽酸萘已二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min，以5 mL 樣品液為空白組，在544 nm 處，測定吸光度為A，測定NaNO2標準溶液的吸光度為A0，按以下公式計算樣品液對NO-2 的清除率。

1.4 數據處理與分析

2 結果與討論

2.1 板栗花純露清除DPPH 自由基的能力

不同濃度的板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液清除DPPH 自由基能力見圖1。由圖1 可以看出，樣品液對DPPH 自由基的清除率隨濃度的增加而增大，當樣品液濃度達到0.5 mg/mL 時，清除率趨于穩定。此時板栗花純露的清除率為80.64%;六神樣品液的清除率為70.21%;隆力奇樣品液的清除率為60.14%;Vc 溶液的清除率為90.04%。

許多學者對天然產物中的黃酮類［13，14］和多酚類［15］化合物清除DPPH 自由基能力進行了研究，而鮮見對其他類物質的研究報道，特別是植物純露清除DPPH 自由基方面的研究僅見2014 年孟慧報道［16］，她在研究四種芳香植物純露體外抗氧化活性中發現，當濃度為0.376 mg/mL 時，薰衣草純露、肉豆蔻純露、沉香純露和降香純露對DPPH 自由基的清除率分別為58.217%、52.098%、9.016% 和8.525%。由DPPH 自由基清除率/樣品液濃度曲線的擬合回歸方程可知，當板栗花純露的濃度為0.376mg/mL時，DPPH自由基的清除率為66.325%，而且當板栗花純露濃度為0.5 mg/mL 時，與六神、隆力奇樣品液相比，DPPH 自由基的清除率分別提高了15%(P＜0.01)和34%(P＜0.01)，由此可見，板栗花純露較報道的其他植物純露抗氧化性更強，顯示出板栗花純露具有較強的清除DPPH 自由基能力。

圖1 板栗花純露對DPPH 自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of the hydrosol from chestnut flower

由板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液的擬合線性回歸方程計算各個樣品液清除DPPH 自由基的IC50值分別為0.25、0.32、0.38 mg/mL 和0.21 mg/mL。板栗花純露清除DPPH 自由基的IC50為0.25 mg/mL，明顯優于兩種市售花露水但略小于Vc(P＜0.01)。實驗各組樣品清除DPPH 自由基能力大小順序依次為:Vc ＞板栗花純露＞六神樣品液＞隆力奇樣品液。

2.2 板栗花純露的還原能力

不同濃度的板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液的還原能力見圖2。由圖2 可知，板栗花純露的吸光度隨濃度的增大而增加，當濃度為1.5 mg/mL 時，吸光度達到最大值為0.88，之后略有下降，即板栗花純露的還原能力隨濃度也是先增加后降低，濃度為1.5 mg/mL 時，還原能力最強。同樣，隆力奇和六神樣品液的吸光度隨濃度呈現相同的趨勢，但沒有板栗花純露還原力那樣穩定，同等濃度下，板栗花純露的還原能力相對較大，抗氧化能力相對較強。實驗結果反映出板栗花純露的還原能力雖然不及同濃度的Vc 但卻遠大于六神、隆力奇樣品液(P＜0.01)，這可能是板栗花純露中存在某些具有抗氧化活性的多酚類物質，充當了供電子的還原劑，從而表現出較強的還原能力［17］。

圖2 板栗花純露的還原能力Fig.2 Reducing power of the hydrosol from chestnut flower

2.3 板栗花純露清除羥基自由基的能力

不同濃度的板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液清除羥基自由基能力見圖3。由圖3 可知，樣品液對羥基自由基的清除率隨濃度的增大而增加，當濃度為0.1 mg/mL 時，清除率達到最大值，之后保持穩定。此時，板栗花純露的清除率為74.03%，六神樣品液的清除率為61.24%，隆力奇樣品液的清除率為64.84%，Vc 的清除率為29.98%。相比，板栗花純露對羥基自由基的清除率最大且分別提高了21%(P＜0.01)、14%(P＜0.01)和147(P＜0.01)。

生物體在氧化呼吸過程中，伴隨著能量的產生，會形成一定量的活性氧(ROS)，然而生物在進化過程中，自身擁有一套完整的抗氧化防御體系，能及時清除產生的ROS，從而保證細胞正常的能量和物質代謝的順利進行［18］。當細胞受到紫外線等射線的輻射脅迫時，能誘導產生超氧陰離子(O-·2)、過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(OH·)等活性氧［19］，使細胞內ROS 不斷積累，當超過自身清除能力時，過多的ROS 積累則導致迸發現象的發生。同時ROS 能氧化細胞膜中有多個不飽和雙鍵的脂類物質，形成丙二醛(MDA);MDA 與蛋白質、核酸或脂類發生交聯，破壞細胞結構與功能，造成細胞的氧化損傷［20］。在體外實驗體系中，環境中的Fe3+和Fe2+能催化過氧化氫和超氧陰離子反應生成羥基自由基，羥基自由基是活性氧中反應能力最強的一種，它幾乎可以和細胞內的一切有機物反應，它能殺死紅細胞，降解細胞膜、DNA 和多糖類化合物，引起組織細胞病變，導致疾病發生和加速機體衰老［21］。本實驗利用此原理，測定板栗花純露清除羥基自由基能力，以反映板栗花純露的抗氧化性能。實驗結果證實板栗花純露具有較強的抗氧化性，可作為潛在的防曬產品。

許多天然抗氧化劑常顯示出強有力的清除羥基自由基能力，其原因可能正是由于天然產物中含有化學結構復雜且濃度很低的多種物質，如板栗花純露中包含精油的一些組分，如芳樟醇、香葉醇等。混合的抗氧化劑較單一的合成抗氧化劑有更多的還原基團，具有提供氫質子的能力，可使具有高度氧化性的自由基還原，從而終止自由基連鎖反應，起到清除或抑制自由基反應的目的。李榮［22］等在研究肉豆蔻精油抗氧化性能時，發現天然抗氧化劑的羥基自由基清除能力強于2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)和沒食子酸丙酯(PG)等合成抗氧化劑。這一結果與我們的一致。

2.4 板栗花純露清除亞硝酸鹽的能力

圖3 板栗花純露對羥基自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ability of the hydrosol from chestnut flower

不同濃度的板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液清除亞硝酸鹽的能力見圖4。由圖4 可見，板栗花純露對亞硝酸鹽清除率隨著濃度的增大而增加，當濃度為4 mg/mL 時，清除率達到最大值為84.77%，之后略有降低。

人攝食亞硝酸鹽含量高的食物后，患癌癥的風險會顯著增加，這是由于胃中的食物處在酸性條件下，亞硝酸鹽可與食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反應生成強致癌物亞硝胺，該物質具有較強的致癌作用［23］。板栗花純露對亞硝酸鹽的清除能力明顯優于其他三種樣品液，這說明了板栗花純露不僅具有開發成為新型防曬花露水的潛力，同時也具備作為一種天然抗氧化劑應用于食品行業的可能性。

圖4 板栗花純露對亞硝酸鹽的清除能力Fig.4 Nitrite scavenging ability of the hydrosol from chestnut flower

3 結論

板栗花純露在一定濃度范圍內具有良好的抗氧化活性，當板栗花純露濃度為0.5 mg/mL 時，清除DPPH 自由基能力最強，清除率為80.64%，IC50為0.25 mg/mL;濃度為1.5 mg/mL 時，還原能力最強;濃度為0.1 mg/mL 時，清除羥基自由基能力最強，清除率為74.03%;濃度為4 mg/mL 時，清除亞硝酸鹽能力最強，清除率為84.77%。在實驗各處理組相同濃度下，板栗花純露清除羥基自由基和亞硝酸鹽能力最好;而清除DPPH 自由基能力和還原能力弱于Vc。板栗花純露抗氧化機理復雜，還有待進一步地討論和研究。

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