用膠原纖維分離含不同糖基數的黃酮苷類化合物

丁平平，廖學品，張文華，石 碧*

1四川大學化工學院化工系;2 四川大學制革清潔技術國家工程實驗室;3 四川大學生物質化學與工程系，成都 610065

黃酮苷是由糖或糖的衍生物(如氨基酸、糖醛糖等)與黃酮通過脫水縮合而成的化合物，是自然界中分布最廣泛的一類黃酮化合物，在眾多植物提取物中大量共存［1］。黃酮苷類化合物的分子結構相似，具有基本相同的母體結構，僅母體各位點取代基有所不同，這使其分離困難。目前大多采用柱層析法對黃酮苷類化合物進行分離純化，但傳統的柱層析填料如聚酰胺、硅膠和葡聚糖等存在洗脫難和不易再生等缺陷。近年來，廣泛使用大孔吸附樹脂進行這類天然產物的分離純化。

膠原纖維是一種天然高分子，來自家畜動物的皮，原料易得，使用安全，生物相容性好，可生物降解性。它含有大量的活性基團如肽鍵、-OH、-COOH、-NH2等［2］，能與多酚、黃酮類化合物上的酚羥基形成氫鍵。本課題組的前期研究表明，用膠原纖維制備的分離材料能選擇性除去植物提取物中的單寧，這是因為單寧富含酚羥基，能與膠原纖維以多點氫鍵結合，而其他化合物與膠原纖維形成的氫鍵作用力較弱［3］。膠原纖維分離材料也能有效分離黃酮苷和含吡啶環的生物堿混合物［4］，這也是因為與生物堿相比，黃酮苷與膠原纖維的氫鍵作用更強。研究還表明，膠原纖維能分離黃酮和黃酮苷的混合物，這是由于兩者的結構差異較大，與膠原的氫鍵結合能力不同［5］。這些研究表明，膠原纖維分離材料主要基于對被分離物的氫鍵作用力差異而將其分離。被分離化合物所含可形成氫鍵的活性基團的數目和位置，能極大的影響氫鍵作用力。黃酮苷類化合物中的糖基能與膠原纖維的活性基團形成氫鍵，通過調控膠原纖維與黃酮苷類化合物之間的氫鍵作用強度，有可能將不同的黃酮苷類化合物分離開。

為了使研究結果具有代表性，本文選用分別含1 個、2 個和3 個糖基的黃酮苷(槲皮苷、蘆丁和刺槐素)作為黃酮苷類化合物的代表，研究了膠原纖維分離材料(GCF)對黃酮苷類混合物體系的分離特性。從衛生和環保角度考慮，采用蒸餾水和乙醇作為洗脫劑。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑:無水乙醇等試劑均為分析純。HPLC 分析用甲醇和甲酸為色譜純(Fisher Chemicals)，實驗用水經Millipore 超純水制備系統凈化。槲皮苷和蘆丁，購自陜西慧科植物開發有限公司，含量均為98%以上;刺槐素，購自湖州恩貝希生物原料有限公司，含量95%以上。三種黃酮苷的分子結構式見圖1。儀器:Alliance2996 高效液相色譜儀，美國Waters公司;Aichrom bond-AQ C18 反相色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);UV751GD 紫外可見分光光度計，美國PerkinElmer 公司;BSZ-100 型自動收集器、HL-2型恒流泵，上海滬西分析儀器廠;層析柱(16 mm ×50 cm)，成都凌云玻璃廠。

1.2 膠原纖維分離材料的制備

圖1 槲皮苷(1)、蘆丁(2)和刺槐素(3)的分子結構Fig.1 Molecular structures of quercitrin(1)，rutin (2)and robinin (3)

膠原纖維分離材料的制備按課題組建立的方法進行［6］。其簡要步驟為:以牛皮為原料，按常規方法經清洗、堿處理、片皮、脫堿、干燥、研磨等操作制得膠原纖維;取膠原纖維15 g，用300 mL 蒸餾水浸泡12 h，加入10 mL 50%的戊二醛，先于25 ℃下反應1 h，然后于30 ℃下反應4 h。過濾后用蒸餾水洗滌3 次，再用無水乙醇洗滌，過濾，于45 ℃下干燥12 h 得到膠原纖維分離材料(GCF)。

1.3 乙醇濃度對GCF 吸附刺槐素、槲皮苷和蘆丁的影響

由于三種黃酮苷化合物難溶于水，易溶于乙醇，因此采用乙醇濃度高于30%溶液進行靜態吸附實驗。分別采用乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%(v/v)的乙醇-水溶液配制100.0 mL 刺槐素、槲皮苷和蘆丁混合溶液(溶液中各成分濃度均為30 mg/L)。取上述各溶液15.0 mL，加入0.15 g GCF，在298 K 下振蕩吸附12 h。用HPLC 檢測吸附前后溶液中各成分的濃度，用公式(1)計算吸附率E。

式中，E 為吸附率，C0為吸附前HPLC 峰面積，Ce為吸附后HPLC 峰面積。

1.4 柱分離

用無水乙醇配制刺槐素-蘆丁、槲皮苷-蘆丁、刺槐素-蘆丁-槲皮苷的混合溶液，混合溶液中各成分的濃度均為5 mg/mL。這些混合溶液為柱分離上樣液。

稱取10.0 g GCF，用無水乙醇浸泡12 h，以濕法裝柱的方式裝入直徑為16 mm 的層析柱內，柱高為30 cm，柱體積為60 mL，空隙體積為14.7 mL。先用洗脫液預平衡色譜柱2 BV，然后分別取上述上樣液1 mL 進行上樣(無需過濾)。上樣結束后在0.5 BV/h 的恒定流速下對色譜柱進行分步洗脫。用自動收集器定時收集流出液，并HPLC 檢測流出液中各成分的濃度。

1.5 GCF 的重復使用性

選用對刺槐素-蘆丁-槲皮苷的分離考察GCF 的重復使用性。上樣液的配制和柱分離方法同1.5，用自動收集器定時收集流出液，用HPLC 測定合并洗脫段中槲皮苷、蘆丁和刺槐素的濃度，根據公式(2)和(3)計算純度P 和回收率R。

其中，mi 為單獨組分質量(μg);m 為分離得到的組分總質量(μg);

其中M 為槲皮苷(蘆丁或者刺槐素)上樣質量(mg);m 為分離得到的槲皮苷(蘆丁或者刺槐素)的質量(mg)。

每次分離結束后，分別用180 mL 90%(v/v)乙醇水溶液以0.25 BV/h 的恒定流速洗滌和平衡色譜柱，然后再重復進行分離實驗。

2 結果與討論

2.1 乙醇濃度對吸附的影響

圖2 為刺槐素、蘆丁和槲皮苷在不同濃度的乙醇水溶液中的靜態吸附率。當乙醇濃度低于70%時，GCF 對三種黃酮苷的吸附率均低于30%;當乙醇濃度高于80%時，吸附率均明顯增加。這表明，GCF 在高乙醇溶液中對三種黃酮苷具有較高的吸附選擇性。對圖2 綜合分析可以發現，蘆丁在50%～70%乙醇水溶液中吸附率都較低，因此可以該濃度范圍的乙醇水溶液作為蘆丁的洗脫液;而刺槐素在50%乙醇水溶液中吸附率最低，因此50%乙醇水溶液可作為其洗脫液。根據上述結果推測通過分步洗脫的方式(改變洗脫液中乙醇濃度)能夠在GCF上將三種物質分離開。

圖2 三種黃酮苷化合物在不同濃度乙醇-水溶液中的吸附率Fig.2 Adsorption extents of three flavone glycosides on GCF in different aqueous ethanol solutions

2.2 吸附機理

已有的研究表明，膠原纖維和植物多酚主要通過分子間多點氫鍵和疏水鍵的協同作用而結合［6］。因此，氫鍵和疏水作用可能是GCF 吸附黃酮苷類化合物的主要機理。在水含量較高的溶液中，水分子作為良好的氫鍵受體和供體，能夠分別與GCF、黃酮苷類化合物形成氫鍵，這種競爭反應導致GCF 與黃酮苷類化合物之間的氫鍵作用力減弱。因此，在乙醇濃度小于50%的溶液中，GCF 的脂肪側鏈與吸附質疏水區之間的疏水作用是吸附質在GCF 上吸附的主要驅動力。由于黃酮苷類化合物的疏水性差別不大，因此在低濃度的乙醇水溶液中，GCF 對黃酮苷類化合物的吸附率均較低。

乙醇濃度大于70%時，GCF 與吸附質之間的疏水作用受到抑制，而它們之間的氫鍵卻更容易形成。這是因為乙醇的極性小于水的極性，乙醇參與氫鍵競爭反應的能力小于水。在純乙醇中，氫鍵是GCF與吸附質之間的主要作用力，這時三種黃酮苷的吸附率都達到最大。如圖2 所示，GCF 對三種黃酮苷的吸附率大小順序為:刺槐素＞蘆丁＞槲皮苷。三種化合物的氫鍵活性位點主要是羥基，含3 個糖基的刺槐素有更多的氫鍵活性位點，因此GCF 對刺槐素的吸附率最大。蘆丁C-3 位上連接二糖(β-D-葡萄糖基-7-L-鼠李糖)，形成氫鍵的活性基團多于槲皮苷，因而蘆丁的吸附率次之;槲皮苷C-3 位上連接的單糖，故而吸附率最低。以上結果表明，在高乙醇濃度溶液中，GCF 與吸附質之間的主要作用力是氫鍵，GCF 對黃酮苷化合物具有較高的吸附選擇性。

以上實驗結果和分析表明，在低濃度乙醇溶液中，疏水作用是GCF 與吸附質(黃酮苷類化合物)之間的主要作用力;而在高濃度乙醇溶液和純乙醇中，氫鍵是其主要作用力。這與一些學者在研究蠶絲蛋白吸附黃酮類化合物、交聯瓊脂糖凝膠分離EGCG 及大孔樹脂吸附胺類化合物時的吸附機理一致［7，8］。

2.3 兩組分體系柱分離

根據三種黃酮苷化合物的結構，把它們分成兩組合(槲皮苷-蘆丁和刺槐素-蘆丁)，每組中的兩個黃酮苷相差一個糖環，考察分離效果。根據靜態吸附實驗結果，用90%～70%乙醇水溶液以梯度洗脫的方式對蘆丁-槲皮苷混合物進行分離，用70%～50%乙醇水溶液以梯度洗脫方式對刺槐素-蘆丁混合物進行分離。分離色譜曲線如圖3 和4 所示。

圖3 蘆丁-槲皮苷化合物在GCF 柱上的分離色譜圖Fig.3 Separation chromatograms of rutin-quercitrin mixture on GCF column

由圖3 可見，在蘆丁-槲皮苷分離中，槲皮苷在90%乙醇洗脫段被全部洗脫，而蘆丁在70%乙醇水溶液段被洗脫。這是由于采用90%乙醇作洗脫液時，GCF 與含羥基較少的槲皮苷之間的氫鍵作用較弱，而與含羥基較多的蘆丁之間的氫鍵作用強，因此蘆丁保留在GCF 柱上。隨著洗脫液中水的比例的增加，GCF 與蘆丁之間的氫鍵被破壞，使之被洗脫下來。

圖4 刺槐素-蘆丁化合物在GCF 柱上的分離色譜圖Fig.4 Separation chromatogram of robinin-rutin mixture on GCF column

在刺槐素-蘆丁混合物分離中，蘆丁在70%乙醇水洗脫段被全部洗脫，而刺槐素被保留在柱上。這表明刺槐素與GCF 的吸附作用更強，這與刺槐素含更多可形成氫鍵的-OH 是一致的。實驗結果表明，通過改變洗脫液的組成，可以調節三種黃酮苷化合物在GCF 柱上的保留時間，通過分步洗脫的方式使它們在GCF 柱上得到分離。

為了進一步研究三種黃酮苷化合物在GCF 柱上的分離特性，計算了色譜峰分離度這一重要參數。采用Gaussian 方程［9］對色譜曲線進行擬合，從而獲得分離度。Gaussian 方程是較常用的擬合模型，該模型假設色譜流出曲線符合高斯分布函數，即是左右對稱的峰。

其中A 為峰面積;w 為半峰寬;xc 為峰中心值。

擬合參數如表1 所示。Gaussian 方程對兩組分體系色譜曲線的擬合相關系數都大于0.97，槲皮苷-蘆丁和刺槐素-蘆丁體系在GCF 柱上的色譜曲線符合Gaussian 分布，表明在GCF 柱上的色譜峰較對稱，沒有明顯的區帶擴散現象，柱效較高。根據Gaussian 方程擬合得到的數據，按分離度公式(5)計算兩組分體系在GCF 柱上的分離度。

其中V1 和V2 分別為相鄰兩物質各自的洗脫體積;W1 和W2 分別為兩個化合物對應的色譜峰的半峰寬度。

槲皮苷-蘆丁和刺槐素-蘆丁體系在GCF 柱上的分離度如表1 所示。分離度是色譜柱總分離效能的衡量指標，分離度越大，表明相鄰組分分離越好。當分離度小于1 時，兩組分有部分重疊;當分離度等于1 時，兩組分有較好的分離;當分離度等于1.5 時，兩組分完全分開，也稱為基線分離［10］。槲皮苷和蘆丁在GCF 柱上的分離度為3.60，而蘆丁和刺槐素的分離度為2.47，表明GCF 柱能實現刺槐素-蘆丁和蘆丁-槲皮苷兩組份的完全分離，且具有較高的分離效能。

表1 兩組分黃酮苷混合物分離曲線的Gaussian 方程擬合參數Table 1 Gaussian fitting parameters for separation curve of two-component mixture of flavone glycosides

2.4 三組分柱分離

根據兩組分黃酮苷混合物的分離結果，考察了GCF 柱對刺槐素-蘆丁-槲皮苷構成的三組分的分離效果，采用90%-70%-50%乙醇水溶液分步洗脫分離。由圖5(a)可見，在90%乙醇水溶液洗脫段，實現槲皮苷與蘆丁、刺槐素分離;采用70%乙醇水溶液可以將蘆丁洗脫，而刺槐素被保留在GCF 柱上;50%乙醇水可將刺槐素的洗脫。這表明三種黃酮苷類化合物能夠在不同的溶劑中被洗脫從而實現分離，這是因為它們與GCF 之間形成氫鍵的能力存在差異。

當用30%乙醇水溶液洗脫時，三種化合物幾乎同時從色譜柱上流出，沒有達到分離效果，如圖5(b)所示。該對比實驗結果進一步證實:在無水乙醇及高濃度乙醇溶液中，GCF 與吸附質之間以氫鍵作用為主，在水中則以疏水作用為主。且基于氫鍵作用，GCF 能夠有效地分離含不同糖基數量黃酮苷類化合物，基于疏水作用則沒有分離效果。

圖5 刺槐素-蘆丁-槲皮苷混合物在GCF 柱上的分離色譜圖Fig.5 Separation chromatograms of robinin-rutin-quercetin mixture on GCF column

2.5 GCF 柱的重復使用性

分離材料的重復使用性對其實際應用具有非常重要的意義，故對GCF 柱的重復使用性能進行了研究。圖6 是GCF 柱第1 次和第5 次重復使用分離刺槐素-蘆丁-槲皮苷混合物的色譜圖。可以看出，第1 次和第5 次分離中，三組分體系的保留時間基本一致。在5 次重復分離中，三種黃酮苷化合物的回收率均大于75%，如表3 所示。上述的實驗結果表明，GCF 柱在黃酮苷類化合物分離中具有良好的重復使用性和穩定性。

圖6 刺槐素-蘆丁-槲皮苷混合物在重復使用GCF 柱上的色譜圖Fig.6 Separation chromatograms of robinin-rutin-quercitrin mixture on regenerated GCF column

表3 重復使用GCF 分離三種黃酮苷化合物時產物的純度和回收率Table 3 Purity and recovery of flavone glycosides separated by regenerated GCF column

3 結論

戊二醛交聯膠原纖維分離材料對黃酮苷類化合物的吸附分離主要是基于氫鍵作用。含不同糖基數量的黃酮苷類化合物與膠原纖維之間的氫鍵作用力不同，因此可以用膠原纖維分離材料對它們的類混合物進行分離純化。同時，膠原纖維分離材料用于黃酮苷類化合物分離時，表現出良好的可重復使用性，因此具有良好的實用價值。

1 Zhao YY，Wang JH，Fu XT，et al.Simultaneous determination of eleven flavonoid glycosides in Ginkgo biloba leaves collected in different seasons by UPLC PDA method.Acta Pharm Sin，2013，48:98-103.

2 Liao LL(廖隆理).Leather Chemistry and Engineering(制革化學與工藝學).Beijing:Science Publishing House，2005:107-118.

3 Liao XP(廖學品)，Ma HW(馬賀偉)，Lu ZB(陸忠兵)，et al.Selective removal of tannins from extracts of Chinese medicinal herbs.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2004，16:10-15.

4 Li J，Liao XP，Liao GH，et al.Separation of flavonoid and alkaloid using collagen fiber adsorbent.J Sep Sci，2010，33:2230-2239.

5 Zhang QX(張琦弦)，Liao XP(廖學品)，Shi B(石碧)，et al.Separation of flavanoneglycosides and aglyconesmixture using collagen fiber adsorbent.J Sichuan Univ，Eng Sci Ed(四川大學學報，工程科學版)，2012，44:244-254.

6 Liao XP，Lu ZB，Shi B.Selective adsorption of vegetable tannins onto collagen fibers.Ind Eng Chem Res，2003，42:3397-3402.

7 Baycin D，Altiok E，Ulku S，et al.Adsorption of olive leaf(Olea europaea L.)antioxidants on silk fibroin.J Agric Food Chem，2007，55:1227-1236.

8 Xu J，Tan TW，Janson JC.Mixed-mode retention mechanism for (-)-epigallocatechin gallate on a 12% cross-linked agarose gel media.J Chromatogr A，2006，1137:49-55.

9 Zhang YK(張玉奎)，Dong LF(董禮孚)，Bao MS(包綿生)，et al.色譜流出曲線的曲線擬合法.J Instru Anal(分析測試通報)，1984，2:16-19.

10 Chen HL(陳歡林).The new separation technology(新型分離技術).Beijing:Chemical Industry Publishing House.2005，268-275.