油樟油對油樟內生真菌中活性化合物影響

譚韻雅，盧 紅，李 群*，魏 琴

1四川師范大學生命科學學院，成都 610101;2 宜賓學院發酵資源與應用四川省高校重點實驗室，宜賓 644000

植物內生菌是與其宿主在長期的協同進化過程中形成了互利互惠、無害或微害的寄生關系的菌群。目前研究植物內生菌的生物學作用已逐漸成為熱點，對于內生菌發酵生產代謝產物的報道較多［1，2］。但直接從植物中分離得到的內生菌發酵產物普遍含量較低，不利于直接用于工業生產，需要對其進行優化［3，4］。優化內生菌的方式非常多，其中添加前體物質等誘導物來促進其產物的生產是一種常用且有效的方法［5，6］。

1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇、r-松油烯均是重要的天然產物，存在于多種植物精油之中，在醫藥、香料和日用化學品等方面均有重要的用途，有較高的經濟價值［7，8］。目前多是直接從植物中提取來獲得這些物質，但存在產量少，受季節限制等局限性。因此本研究試圖在產生這些天然產物的內生菌中添加誘導物，探索不同培養條件下這些天然產物的產量，旨在提高天然產物的產量。

本研究使用的內生菌是游玲等［9，10］2009 年從油樟中分離得到的，且經過分析發現這些內生菌能生產1，8-桉葉油素等物質。但其產量低，相對含量在8.5 %至16.7%之間，需優化提高其產量。本研究使用的油樟油是一種天然的芳香油，用它作原料，可以得到許多重要的香料、香料參合劑或其它的化工產品［11］。本研究參照陶翠等［12］2011 年對油樟葉揮發油對幾種真菌的抗菌效果的報道，再加上前期的預實驗，以4%油樟油水濁液作為誘導劑添加在可產1，8-桉葉油素等物質的幾種內生菌中，探索油樟油對內生菌產物的影響，旨在能提高1，8-桉葉油素等天然產物的產量，為這些產物能否工業化生產提供依據。目前這方面的研究未見相關報道。

1 材料與儀器

1.1 材料

油樟內生真菌YY26、YG42 和YG71 由宜賓學院發酵資源與應用四川省高校重點實驗室從宜賓市采集的油樟中分離獲得。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA):去皮馬鈴薯200 g煮沸30 min 過濾，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水定容至1000 mL，pH 自然。馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB):去皮馬鈴薯200 g 煮沸30 min 過濾，葡萄糖20 g，加水定容至1000 mL，pH 自然。察氏培養基:蔗糖30 g，硝酸鈉3 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，磷酸氫二鉀1 g，瓊脂12 g，水1000 mL，pH 自然。

1.3 主要試劑

1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇和r-松油烯四種標品均由宜賓市舊州志林商貿有限責任公司江南香料化工廠提供。乙醇為色譜純級別。

1.4 儀器

氣相色譜儀［Agilent7890A、火焰離子化檢測器(FID)］，氣-質聯用儀(Agilent 7890A/ 5975C)，超凈工作臺(SW-CJ-ZF)，恒溫培養搖床(THZ-300)，恒溫培養箱(BPH-9082)。

2 實驗方法

2.1 油樟內生真菌的培養

從保藏的試管斜面挑取適量YY26、YG42 和YG71 菌種，分別接種于PDA 平板上活化，在長出的菌落邊緣取直徑6 mm 的菌絲塊3 塊，轉入裝有50 mL 培養液的搖瓶中，28 ℃，180 rpm 搖床培養8 d。

2.2 油樟油水濁液的制備

2.2.1 油樟葉揮發油的制備

新鮮油樟葉洗凈后剪碎至適當粒度放入1 L 的圓底燒瓶中，用水蒸氣蒸餾法提取4 h，然后乙醚萃取、旋轉濃縮后用無水硫酸鈉干燥，得油樟葉揮發油。

2.2.2 混合乳化劑的制備

吐溫-80 和斯盤-80 按照7∶3 的比例混合，混合后于60 ℃水浴，然后充分攪拌后。此混合乳化劑的HLB(親水親油平衡值)值為12.0(水包油乳化劑)。

2.2.3 油樟油水濁液的制備

先將油樟葉揮發油和乳化劑(HLB 值為12.0)按照1∶5 的比例混合，加入研缽中，順著一個方向充分研磨1 min 左右，再加入溶劑水繼續研磨，過濾滅菌后放入4 ℃冰箱保存備用。

2.3 實驗方案

在PDB 培養基和察氏培養基中加入4%油樟油水濁液，再分別接入真菌YY26、YG42、YG71，同時設置相應對照。每組實驗設三個重復，如表1。在28 ℃，180 rpm 搖床中培養8 d 后，將培樣瓶中的物質均勻混合后取10 mL 放入頂空進樣瓶中，進行GC-FID 檢測。采用外標法定量。取其中產物較多的一組樣品進一步做GC-MS 檢測，以此來確認產物。

2.4 標品的配制

分別稱取0.5 g 1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯標品于50 mL 容量瓶中用乙醇定容，制成10 g/L 的標準溶液。

取配好的10 g/L 的1，8-桉葉油素標準溶液，稀釋成濃度分別為50、20、5、1、0.5、0.1 mg/L 的標準溶液，用以建立1，8-桉葉油素的標準曲線。

取配好的10 g/L 的r-松油烯標準溶液，稀釋成濃度分別為1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01 mg/L 的標準溶液，用以建立r-松油烯的標準曲線。

分別取配好的10 g/L 的a-松油醇和松油烯-4-醇標準溶液，分別稀釋成濃度為10、5、1、0.5、0.05、0.01 mg/L 的標準溶液，用以建立a-松油烯和松油烯-4-醇的標準曲線。

2.5 GC-FID 檢測

色譜條件:HP-5(30 m ×250 μm ×0.25 μm)毛細管柱，平衡溫度90 ℃，平衡時間10 min。載氣為氮氣，氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min，氮氣尾吹氣25 mL/min，頂空不分流進樣。柱箱程序:90 ℃保持4 min，然后5 ℃/min 到130 ℃保持5 min，然后5 ℃/min 到190 ℃保持3 min。

2.6 GC-MS 檢測

2.6.1 色譜條件

HP-5(30 m × 250 μm × 0.25 μm)毛細管柱;進樣口溫度230 ℃;載氣為He 流量1 mL/min;分流比3∶1，分流流量3 mL/min。色譜柱程序升溫條件:初始溫度90 ℃保持4 min 然后5 ℃/min 到130 ℃保持5 min 然后5 ℃/min 到190 ℃保持3 min。

2.6.2 質譜條件

離子源為EI 源，電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質譜接口溫度280 ℃;質量掃描范圍為m/z 35～400。

2.7 精密度和穩定性試驗

取2.4 中配制好的10 g/L 標準溶液，用乙醇為溶劑配制成10 mg/L 的混標，取10 mL 于頂空進樣瓶中，按2.5 方法重復進樣5 次，計算1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯標準溶液的峰面積RSD(%);取同一供試品在同一天內重復進樣5 次，并連續進樣3 天，計算1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯的峰面積日內與日間RSD(%)。

2.8 回收率試驗

取2.4 中配制好的10 g/L 標準溶液，用乙醇為溶劑配制成10、5、1 mg/L 的混標，分別取5 mL 于頂空進樣瓶中，再分別加入5 mL 已測樣品，依2.5 中方法測定，計算出回收率及RSD(%)。

2.9 統計分析

本實驗所有數據均使用SPSS17.0 軟件進行方差分析。

圖1 標品(A)和樣品(B)的GC-FID 分析色譜圖Fig.1 GC-FID TICs of standard (A)and sampl (B)

3 結果與討論

3.1 標準曲線的建立及樣品中物質的確認

3.1.1 標準曲線的建立

在2.5 色譜條件下，各個標品以2.4 中所配制的濃度梯度進樣，以進樣濃度和峰面積進行回歸分析，求得1，8-桉葉油素的回歸方程為Y=0.016X +0.0301，R2=0.9995;r-松油烯的回歸方程為Y=0.0127X+0.0016，R2=0.9992;松油烯-4-醇的回歸方程為Y=0.0346X +0.0286，R2=0.9996;a-松油醇的回歸方程為Y=0.0552X-0.0221，R2=0.9999。

3.1.2 樣品中物質的確認

幾種標品的GC-FID 檢測結果如圖1A 所示。由圖1A 可知，標品1，8-桉葉油素的出峰時間為5.134 min;r-松油烯的出峰時間為5.543 min;松油烯-4-醇的出峰時間為7.162 min;a-松油醇的出峰時間為7.383 min。圖1B 為樣品GC-FID 檢測的其中一個結果圖。比較圖1A 與圖1B 發現樣品在相近的時間出現與標品相應的峰，初步判斷樣品中有1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和a-松油醇。而r-松油烯未見出峰，可能沒有這個產物或該產物產量過低未被檢測出來。

樣品的GC-MS 檢測結果顯示，樣品中1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇的質譜圖與標準質譜圖相對比，匹配度分別達到98%、89%、90%，證明樣品中相應峰所對應物質確實與標品為同一物質。

3.2 精密度和穩定性試驗結果

精密度試驗中1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯標準溶液的峰面積RSD(%)分別為2.69、1.23、1.42、1.96，表明進樣過程中進樣量基本一致;穩定性試驗中1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯的峰面積日內RSD(%)分別為1.99、2.12、2.11、1.59，日間RSD(%)分別為3.44、2.89、4.12、3.16，表明供試品溶液在所測時間內基本穩定。

3.3 回收率試驗結果

2.8試驗中1，8-桉葉油素、a-松油醇、松油烯-4-醇、r-松油烯的平均回收率(n=3)分別為101.22%，100.34 %，98.97 %，103.01 %;RSD(%)分別為2.89，1.71，1.99，2.62。

3.4 GC-FID 檢測結果

通過GC-FID 檢測，明確了各標本吸收峰的出峰時間。通過標品與樣品GC-MS 質譜檢測，確定樣品中相同出峰時間的物質與相應的標品為同一物質。在此基礎上對所有實驗處理進行了GC-FID 檢測，結果如表1 所示。

3.4.1 未加油樟油時內生菌中天然產物含量情況

從表1 可知，在未加油樟油的處理中(即3、4、5、9、10、11 處理)，三種菌均能生成1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇，不能生成r-松油烯。其中不同菌株在不同培養基中均表現為1，8-桉葉油素的產量最高，最高產量可達0.18 mg/L(9、10 處理);其次為松油烯-4-醇，其最高產量為0.08 mg/L(4 處理);a-松油醇的產量最低，其最高產量僅為0.05 mg/L(4 處理)。

未加油樟油的處理組之間的對比發現(即3、4、5 之間相互比較;9、10、11 之間相互比較):在PDB培養基中，1，8-桉葉油素產量最高的是YG71 菌株，產量可達0.16 mg/L，其次是YY26 菌株，YG42 菌株的產量最低;對松油烯-4-醇和a-松油醇的產量來說，最高的均是YG42 菌株，產量分別可達0.08 mg/L 和0.05 mg/L;YY26 菌株的產量次之，YG71 菌株的產量最低。在察氏培養基中，YG42 和YY26 菌株的1，8-桉葉油素產量較高，產量均為0.18 mg/L，YG71 菌株的產量較低;YG42 和YG71 菌株中松油烯-4-醇和a-松油醇產量均相同且較高，分別為0.07 mg/L 和0.02 mg/L，YY26 菌株的產量較低。

由此可見，對未加油樟油的PDB 培養基和察氏培養基中內生菌產物進行對比分析得出:除YG42菌株中松油烯-4-醇和a-松油醇產量PDB 培養基比察氏培養基中的產量高外，其余均是察氏培養基中的產量更高，即察氏培養基的產物總量高于PDB 培養基中的產物總量。

3.4.2 加油樟油后內生菌中天然產物含量情況

由表1 可知，在PDB 培養基中，加入油樟油后，YY26 和YG42 菌株中1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇的產量均增加，表明油樟油對YY26 和YG42 菌株中的三種目標產物均有促進的作用。其中對1，8-桉葉油素的促進作用最強，在YY26 菌株中產量提高了1.41 倍，YG42 菌種中產量提高了1.30 倍，與僅加油樟油的處理相比(1 處理)有極顯著的差異;其次對松油烯-4-醇和a-松油醇也有促進作用，只是提高倍數較小，最高僅有0.38 倍。與僅加油樟油的處理相比，仍達到了顯著水平以上(見表2);而在YG71 菌株中，加入油樟油后，1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇的產量均被抑制，與僅加油樟油的處理相比，分別減少0.27、0.31、0.34倍，均達到顯著水平以上(見表2)。

察氏培養基中，加入油樟油后，YY26 菌株中1，8-桉葉油素的產量減少，減少了0.19 倍，與僅加油樟油的處理相比有顯著性差異;松油烯-4-醇和a-松油醇的產量均增加，但與僅加油樟油的處理相比沒有顯著性差異;YG42 菌株中1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇的產量均增加，a-松油醇的產量減少，與僅加油樟油的處理相比均無顯著性差異;YG71 菌株中1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、a-松油醇的產量均減少，與僅加油樟油的處理相比1，8-桉葉油素的產量有及顯著性差異，松油烯-4-醇的產量有顯著性差異，a-松油醇的產量則無顯著性差異，分別減少0.45 倍、0.18 倍0.03 倍。

由此可見，對加了油樟油的PDB 培養基和察氏培養基中內生菌產物進行對比分析得出:除YG71 菌株中松油烯-4-醇和a-松油醇的產量察氏培養基比PDB 培養基高外，其余均是PDB 培養基中的產量更高，即PDB培養基中的產物總量比察氏培養基的產物總量高。這與未加油樟油的處理組結果完全不同。

表1 內生真菌代謝產物GC 檢測結果Table 1 GC detection result for the endophytic fungi metabolites

注:“-”表示不添加:“+”表示添加;與1 處理相比，a0.001＜P＜0.05;aaP＜0.001。Note:″-″ means not added;″+″ means added;compared with 1 treatment，a0.001＜P＜0.05;aaP＜0.001.

表2 油樟油對內生真菌中1，8-桉葉油素等產物的提升倍數Table 2 The multiple of the 4 investigated compounds promoted by C.longepaniculatum oil in endophytic fungi

4 討論

在本研究中，采用了GC-MS 和GC-FID 兩種檢測方式，是因為本實驗所用GC-MS 的最低檢測線較高。而本實驗中部分樣品的物質含量較低，用GCMS 無法檢測，因此采用GC-FID 檢測。同時再選擇幾組含量較高的樣品來做GC-MS 檢測，以此定性。得到的實驗結果如正文所描述。

眾所周知，培養基與誘導物均是影響微生物代謝產物的重要因素。近幾年有大量關于優化培養基來提高微生物代謝產物的報道［13，14］，也有許多通過添加誘導物來促進代謝產物產量提高的報道［15，16］。本實驗中未加油樟油的PDB 培養基與察氏培養基相比，察氏培養基的1，8-桉葉油素等物質積累更多;而加了油樟油的PDB 培養基與察氏培養基相比，PDB 培養基的1，8-桉葉油素等物質積累更多。可以推斷培養基和誘導物對內生菌產物產量均有影響，且它們之間存在交互影響。

在PDB 培養基中，加入油樟油和不加油樟油的實驗結果表明，油樟油可促進YY26、YG42 菌株中積累1，8-桉葉油素，并且積累量分別提高1.41 倍和1.30 倍。有人做過類似的研究，得到類似的結果，如吳欣證明滑桃樹種子提取物能提高其內生菌Streptomyces sp.WXC 菌株中富倫菌素B 的產量［6］，同時證實是因為滑桃樹種子提取物作為誘導物誘導了活性化合物富倫菌素B 生物合成基因的表達。本實驗中油樟油作為誘導物，在YY26 和YG42 菌株中促進1，8-桉葉油素產量的提高，是否也是誘導了1，8-桉葉油素生物合成基因的表達，還有待進一步探討。另外，對YG71 菌株來說，在PDB 培養基和察氏培養基中1，8-桉葉油素均被抑制，推測可能是YG71 利用油樟油中的1，8-桉葉油素將其轉化為了其它物質或者其它原因。Rodríguez P［17］等曾做過關于微生物對1，8-桉葉油素的生物轉化，結果證實1，8-桉葉油素被轉化為2-氧-1，8-桉葉油素等物質。

本實驗初步證明通過添加誘導物或培養基的優化等手段可增加油樟內生菌中1，8-桉葉油素等物質的積累，之后的工作就可從這方面繼續做進一步的研究。該研究為這些天然產物的工業化生產奠定了基礎。

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