超聲波輔助雙水相提取檸檬皮中的檸檬苦素

汪建紅，廖立敏，王 碧，劉 騰

1內江師范學院化學化工學院;2 四川省高等學校“果類廢棄物資源化”重點實驗室，四川內江 641112

四川安岳是中國主要檸檬生產基地之一，被稱為“中國檸檬之鄉”，現有檸檬種植面積20 萬畝以上，年產鮮果25 萬噸以上，產量占全國檸檬總產量的70%［1］。但由于缺乏相應的后處理手段，大量的檸檬皮等被作為垃圾直接丟棄，既造成了資源的浪費，又污染了環境。檸檬皮中含有大量的檸檬苦素等活性成分，檸檬苦素具有抗炎、殺蟲、抗癌、抗HIV等作用［2，3］。將檸檬苦素用于食品等領域，可充分發揮其經濟價值，也可緩解對環境的壓力，引起人們極大關注。

常用的檸檬苦素的提取方法有水提法［4］、有機溶劑法［5］、微波輔助法［6］、超聲波法［7］、超臨界流體萃取法［8］、雙水相萃取法［9-11］等。水提法提取時間長，提取效率低;有機溶劑法操作過程中會用到部分的有毒有害的有機溶劑，污染提取物;微波輔助法用到的微波會對人體構成較大的危害;超臨界流體萃取法，提取效率高，但設備較復雜，能耗大，成本高;超聲波法提取時間短，提取效率高;雙水相萃取法憑借雙水相體系的分相特性，一方面可在較低有機溶劑濃度的條件下獲得和較高相同有機溶劑濃度時一樣的提取效果，一方面還可實現易溶于該有機溶劑的成分和易溶于水的成分的同時溶解，使提取體系固液易于分離，也便于下一步的水溶性和油溶性成分的分離，并且該方法操作簡便，條件溫和，幾乎不存在有機溶劑殘留問題。

本文就結合了超聲波和雙水相萃取法兩種方法的優點，利用超聲波輔助雙水相提取檸檬皮中的檸檬苦素，可同時實現低溶劑用量、較好的提取效果、容易分離固液兩相及水溶性和油溶性成分的目的。傳統的聚合物-聚合物、聚合物-無機鹽等雙水相體系粘度大、難處理，且需反萃取，而乙醇-硫酸銨雙水相體系分相穩定，粘度小，操作簡便，條件溫和，選用試劑無毒，且處理簡便［12，13］。因此本實驗選擇此體系提取檸檬皮中的檸檬苦素，并通過單因素實驗和正交實驗考察了超聲波處理溫度、處理時間、乙醇濃度、料液比、硫酸銨用量、提取溫度、提取時間對提取效果的影響，確定了超聲波輔助雙水相提取檸檬皮中檸檬苦素的最佳工藝條件，并與相同條件下不使用雙水相體系和單純只使用雙水相體系時的提取情況進行了比較，為天然產物中有效成分提取探索了一條新的途徑。

1 材料與設備

1.1 試劑與材料

檸檬苦素標準品，優級純;硫酸銨、乙醇、對二甲氨基苯甲醛、硫酸、三氯化鐵，均為分析純;檸檬，購自四川安岳。

1.2 儀器與設備

KQ-400KDB 型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BT-224S 電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司);SHB-B95型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);TDL-5-A 型低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);T-6 新世紀型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

2 實驗方法

2.1 標準曲線的繪制

參照文獻方法［10］，配制顯色劑溶液及濃度為0.20 mg/mL 的檸檬苦素標準溶液，并通過實驗選擇測定波長為500 nm。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并求出其線性回歸方程為A=7.20C-0.0025，R2=0.9962。

2.2 檸檬苦素的提取與測定

檸檬苦素的提取:取低溫烘干的檸檬皮粉末2.00 g 于250 mL 圓底燒瓶中，按照設定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液和一定量的硫酸銨;先在設定的溫度下在確定的超聲波功率下處理一定時間，然后移去超聲波清洗器，在設定的提取溫度下繼續回流提取一定時間，抽濾，對濾液進行減壓濃縮至干，用無水乙醇溶解并定容到25 mL 容量瓶中。

檸檬苦素的測定:準確移取上述提取液2.00 mL 于50 mL 帶刻度比色管中，用無水乙醇稀釋至25.00 mL，加入5 mL 顯色劑混合溶液，顯色30 min后，在500 nm 波長處測定吸光度。根據標準曲線回歸方程，得到提取液濃度。檸檬苦素得率按照下式計算:

式中，Et 為得率(%);C 為測得的提取液濃度(g/mL);V 為提取液體積(mL);n 為稀釋倍數，m為原料的質量(g)。

2.3 乙醇濃度對提取效果的影響

由于所使用的超聲波發生器的功率無法調節，所以功率是固定的400 W。在硫酸銨用量、乙醇用量、超聲波處理溫度、處理時間、提取溫度、提取時間分別為8 g，30 mL，30 ℃，40 min，40 ℃，1 h 的條件下，選擇不同體積濃度(20%、30%、40%、50%、60%)，重復上述操作。

2.4 超聲波處理溫度對提取效果的影響

在超聲波功率400 W，超聲波處理時間40 min，提取溫度40 ℃，硫酸銨用量8 g，乙醇用量30 mL，提取時間1 h 及上一步確定的乙醇濃度的條件下，選擇不同超聲波處理溫度(30、45、60、75 ℃)，重復上述操作。

2.5 超聲波處理時間對提取效果的影響

在超聲波功率400 W，恒定的乙醇濃度和超聲波處理溫度，提取溫度40 ℃，硫酸銨用量8 g，乙醇用量30 mL，提取時間1 h 的條件下，選擇不同超聲波處理時間(20、30、40、50 min)，重復上述操作。

2.6 正交實驗

方法［10］，在確定的乙醇體積濃度、超聲波處理溫度、超聲波處理時間的情況下，以硫酸銨用量、提取溫度、料液比(m檸檬皮∶V乙醇)、提取時間為考察因素設計L16(44)正交表，并按照此正交表安排實驗，每組實驗條件下重復3 次平行實驗，重復上述操作。

3 結果與討論

3.1 乙醇濃度、超聲波處理溫度和處理時間對提取效果的影響

乙醇濃度、超聲波處理溫度和時間對檸檬苦素的提取效果影響較大，如圖1 所示。

圖1 乙醇體積濃度(A)、超聲波處理溫度(B)及超聲波處理時間(C)對檸檬苦素提取的影響Fig.1 Effects of ethanol volume concentration (A)，ultrasonic treatment temperature (B)and ultrasonic treatment time (C)on the extraction yield of limonin

從圖1 的折線(A)可知，檸檬苦素得率隨著乙醇濃度的增加而逐漸增加，這是由于乙醇體積濃度增加，也增加了雙水相體系上層的乙醇濃度，檸檬苦素在乙醇中的溶解度遠大于在水中［10］。當乙醇體積濃度達到60%后，若繼續增加乙醇濃度，則會有大量晶體從雙水相體系析出，并且也難以形成穩定的雙水相體系，影響檸檬苦素的提取。綜合考慮這些因素，選擇最佳乙醇體積濃度60%。

據圖1 的折線(B)可知，檸檬苦素得率隨超聲波處理溫度的上升而上升，60 ℃時達到最大，此后繼續提高處理溫度，檸檬苦素得率出現了一定程度的下降。這是由于處理溫度上升，使超聲波破壞檸檬皮組織的破壁能力增強，檸檬苦素更易浸出;但在超聲波的作用下，過高的處理溫度會導致檸檬苦素因氧化或被超聲波破壞等因素變質的量增加，也會增加乙醇揮發量。綜合考慮節約能源和檸檬苦素得率這些因素，選擇最佳超聲波處理溫度為60 ℃。

從圖1 的折線(C)可知，檸檬苦素得率隨處理時間的延長而增大，30 min 時達最大值，此后繼續延長處理時間，檸檬苦素得率出現了下降的趨勢。這是由于時間越長，超聲波對檸檬皮細胞壁組織的破壞程度就越大，更有利于檸檬苦素的釋放和進入溶液;過長的處理時間也會增加被超聲波破壞和被氧化變質的檸檬苦素的量。綜合考慮這些因素，選擇最佳處理時間為30 min。

3.2 正交實驗

在乙醇體積濃度為60%、超聲波處理溫度60℃，超聲波處理時間30 min 的條件下，設計L16(44)正交表，并按照此正交表安排實驗，正交實驗設計、實驗結果及極差分析結果見表1，方差分析見表2。

表1 L16(44)正交實驗設計和實驗結果Table 1 L16(44)orthogonal experimental design and results

表2 正交實驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of the orthogonal experiment results

從表1 可看出，檸檬皮中檸檬苦素的得率受到了溫度、提取時間、料液比和硫酸銨用量這4 個因素的交叉影響，各因素影響的主次次序為硫酸銨用量＞料液比＞提取時間＞提取溫度。最佳水平組合為A4B3C2D2，即采用硫酸銨用量12 g，檸檬皮和乙醇的料液比1 ∶20 g/mL，提取時間3 h，提取溫度50℃。

為了進一步確定實驗因子的可信度，對檸檬皮中檸檬苦素得率的正交實驗結果方差分析見表2。從表2 可看到，在檸檬皮所選擇提取工藝正交實驗所選取的因素和水平范圍內，因素A、B、C、D 的影響均未達到顯著水平，即硫酸銨用量、檸檬皮和乙醇的料液比、提取時間和提取溫度對檸檬皮中檸檬苦素的提取影響不顯著。而F 值結果表明，方差分析結果與直觀的極差分析結果一致。

對正交實驗結果進行3 次平行實驗驗證，結果檸檬皮中檸檬苦素得率分別為 0.3092%、0.2941%、0.3634%，平均值0.3222%，這與正交實驗結果一致。

3.3 幾種提取方法的比較

表3 幾種提取方法下的檸檬苦素提取情況對比Table 3 Comparison of extraction results of limonin using different methods

從表3 可知，使用雙水相體系提取檸檬苦素時提取體系固液分離容易，不使用雙水相體系時分離較困難;使用超聲波輔助提取時檸檬苦素得率較高;而超聲波輔助雙水相體系提取時，既具有提取體系固液分離容易的優點，檸檬苦素得率也較高，因此超聲波輔助雙水相提取檸檬苦素確實是一種很有發展前途的提取方法。

4 結論

本文通過設計單因素實驗和正交實驗，得出了超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系的實驗中，影響檸檬皮中檸檬苦素得率指標的因素大小順序為:硫酸銨用量＞料液比＞提取時間＞提取溫度;提取的最佳工藝條件為:乙醇體積濃度60%，超聲波處理溫度60 ℃，超聲波處理時間30 min，硫酸銨用量12 g，檸檬皮和乙醇的料液比1∶20 g/mL，提取溫度50℃，提取時間3 h。通過平行實驗的驗證可知，該方法不但得率較高，而且實驗重現性好，也說明正交實驗得出的結論是正確的。同其他方法相比，超聲波輔助雙水相提取法具有操作簡便，得率高，分離容易等優點。該研究結果對于天然產物中有效成分的提取研究具有一定的參考價值。

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