艾納香葉廢棄物鎮(zhèn)痛、抗炎、止血活性的初步研究

夏 嬿，李 祥，陳建偉

南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023

艾納香是菊科植物艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.新鮮或干燥地上部分［1］。全草含揮發(fā)油，主要成分為左旋龍腦［2］，現(xiàn)栽培于貴州、云南、廣西，是苗、壯族的重要藥物，具有祛風(fēng)除濕，溫中止瀉，活血解毒、鎮(zhèn)痛發(fā)汗、祛痰止咳、通經(jīng)止血等功效［3，4］。近年來國內(nèi)外對艾納香的報道大多圍繞艾納香的溫中止血功效探討其婦科用藥的作用機(jī)制［5-7］，而艾納香祛風(fēng)除濕功效對治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面的影響卻鮮有報道。但是民間驗(yàn)方中卻屢次出現(xiàn)艾納香治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的案例，且效果確切。

艾納香為制取艾片的重要原料，主產(chǎn)區(qū)通常采其鮮葉和嫩枝用傳統(tǒng)的土制水蒸汽蒸餾法［8］提取“艾粉”(為艾納香制取冰片的粗級產(chǎn)品)，再經(jīng)提煉后可制得精制“艾片(天然左旋冰片)”。產(chǎn)地加工往往將提取“艾粉”后的葉子殘渣丟棄，影響了其資源的有效利用。中醫(yī)傳統(tǒng)用藥是采用水煎液，用艾納香葉制取揮發(fā)油只是利用了其中一小部分有效成分，大多有效成分仍存在于提取揮發(fā)油后殘留的廢液和廢渣中。本文對艾納香葉制取揮發(fā)油后的廢棄物進(jìn)行了相關(guān)藥理活性研究，同時探討了其不同極性部位化學(xué)成分的鎮(zhèn)痛抗炎止血活性差異，為進(jìn)一步闡明其治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制及其開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見分光光度計，Spectrum752 型;水浴鍋，HH-S 型，鞏義市英峪予華儀器廠;96 孔板酶標(biāo)儀，BIO-RAD680，美國BIO-RAD 公司;電子分析天平，SHIMADZU-AY220。

1.2 試藥

艾納香干燥的葉，采自貴州羅甸。由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為菊科植物艾納香Blumea balsamifera (L.)DC.葉。將其粉碎，過40 目篩，收集經(jīng)揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油后的葉殘渣，烘干備用。收集提取揮發(fā)油后的廢棄液(即艾納香葉水提液)，濃縮烘干成干浸膏備用。

蘆丁對照品，純度99%，購于中國藥品生物制品檢定所，批號0080-9705;角叉菜膠，購自美國Sigma 公司;考馬斯亮藍(lán)G-250，上海博谷生物有限公司;95%乙醇、50%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、磷酸、氫氧化鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉以上均為分析純，廣東華光科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級昆明小鼠，雌雄各半，25 ±1 g，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號:SUXR(蘇)2012-0004。

2 方法

2.1 艾納香葉殘渣中總黃酮的含量測定［9］

2.1.1 鹽酸-鎂粉反應(yīng)

取1.2 項(xiàng)下艾納香葉殘渣適量，用95%乙醇冷浸30 min 后超聲提取30 min，分取濾液。取濾液1 mL，加鎂粉0.04 g 后滴加濃鹽酸0.2 mL，溶液呈紅色，證明其中含有黃酮類化合物。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品15.17 mg，置100 mL 量瓶中，加95%乙醇70 mL，置水浴上微熱使溶解，放冷，加95%乙醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液(每1 mL 溶液中含蘆丁0.1517 mg)，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取1.2 項(xiàng)下艾納香葉殘渣粉末2 g，至燒瓶中，加95%乙醇100 mL，冷浸30 min 后，在水浴上加熱回流60 min，分取濾液，殘渣加95%乙醇100 mL，繼續(xù)水浴加熱回流30 min，過濾，殘渣用30 mL 95%乙醇洗滌，合并濾液，濾液置250 mL 量瓶中，放冷，加95%乙醇至刻度，搖勻，作供試品溶液，待用。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL 分別置于25mL 量瓶中，各加水至10mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的試劑溶液為空白，在500 nm 波長處測定吸收值。以吸收值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，以對照品濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，求得回歸方程:A=9.3033C +0.0162(r2=0.9921)，線性范圍0～0.048544 mg/mL。

2.1.5 樣品溶液的測定

取艾納香葉供試品溶液，精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL 量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下操作，分別加入5%亞硝酸鈉溶液，10%硝酸鋁溶液，4%氫氧化鈉溶液及水，經(jīng)放置顯色后，于500 nm 波長處測定吸收值，代入回歸方程，以無水蘆丁(C27H30O16)計算總黃酮的含量。

2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取某一濃度對照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下操作，加入顯色劑顯色后，測定吸收值，連續(xù)6 次，計算得RSD 值為0.21%，表明儀器精密度較好。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，按樣品溶液測定項(xiàng)下操作，顯色后每隔5 min 測定其吸收度，共計30 min，其測得值基本不變，RSD 值為2.30%，結(jié)果表明，供試品溶液在顯色后30 min 之內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按供試品溶液制備項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液5 份，依法顯色后測定吸收值，含量平均值為3.494%，RSD 為1.96%，表明重現(xiàn)性良好。

2.1.9 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取5 份已知含量艾納香葉殘渣粉末1 g，分別加入蘆丁對照品，按供試品溶液制備方法制備供試液，按樣品溶液測定方法測定吸收值，測得平均回收率為99.7%，RSD 為2.3%。

2.2 艾納香葉殘渣鎮(zhèn)痛、抗炎、止血藥理活性研究

2.2.1 供試液的制備

取1.2 項(xiàng)下艾納香葉殘渣，以5 倍量95%乙醇浸泡3 h，回流提取2 h，重復(fù)2 次，再以50%乙醇回流提取提取1 次;合并提取液濾液，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇萃取，濃縮干燥后分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、甲醇部位，以及1.2 項(xiàng)下艾納香葉干浸膏分別以0.5%CMC-Na 稀釋成濃度適宜的混懸液備用。

2.2.2 小鼠足腫脹炎癥模型試驗(yàn)［10］

取正常健康小鼠128 只，雌雄各半，隨機(jī)分為葉殘渣石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇部位，分別設(shè)高劑量組、中劑量組、低劑量組以及陽性對照組和空白對照組，共16 組，每組8 只。ig 給藥，連續(xù)5 d，其中空白對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予10 mg/kg 地塞米松，艾納香各部位高、中、低組給藥劑量分別為:石油醚部位64、32、16 mg/kg，乙酸乙酯部位21.6、10.8、5.4 mg/kg，正丁醇部位8.0、4.0、2.0 mg/kg，甲醇部位10.4、5.2、2.6 mg/kg，水提液184.8、92.4、45.2 mg/kg 折合為生藥給藥量均為0.92、0.46、0.23 g/kg。末次給藥后1 h，在每鼠右側(cè)足趾皮下注射1%角叉菜膠0.05 mL，4 h 后沿踝關(guān)節(jié)剪下左右兩足，稱重，計算腫脹度(左右足重量差值)和抑制率。

抑制率%=［1 -用藥組腫脹度均值/空白對照組腫脹度均值］×100%

2.2.3 炎癥組織中PGE2含量及蛋白質(zhì)滲出量測定［10］

取2.2.2 項(xiàng)下試驗(yàn)小鼠右足，充分剪碎，加入生理鹽水3 mL 浸泡12 h，傾倒出上清液，3000 轉(zhuǎn)/min低速離心10 min 后吸取上清液0.1 mL，加0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL，在50 ℃下異構(gòu)化20 min，用甲醇稀釋至20 mL，采用分光光度法(λ=278 nm)測定，以O(shè)D 值推算每克炎性組織中PGE2含量。

2.2.4 小鼠熱板鎮(zhèn)痛試驗(yàn)［10］

取正常健康雌性小鼠，調(diào)節(jié)恒溫水浴水溫(55±0.5)℃，預(yù)熱10 min 后，將小鼠置熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時間為該小鼠痛閾值。選用痛閾值5～30 s 小鼠128 只進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，時間過短、過長、不舔足及跳躍小鼠棄用。給藥劑量及組別同2.2.2項(xiàng)。連續(xù)灌胃給藥8 d。于初次給藥及末次給藥后1.5 h 分別測定小鼠痛閾值，與給空白組痛閾值相比較，觀察給藥前后痛閾值的變化。

2.2.5 小鼠剪尾止血試驗(yàn)［10］

取正常健康小鼠120 只，雌雄各半。隨機(jī)分為艾納香葉殘渣石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇部位高劑量組、中劑量組、低劑量組和空白對照組，共15組，每組8 只。給藥劑量同2.2.2 項(xiàng)。連續(xù)給藥5 d。末次給藥后1 h，將小鼠驅(qū)入特制的固定器中，然后剪去鼠尾尖約3 mm，待血液自行溢出，每隔30 s用濾紙輕輕吸去血滴。以人工形成創(chuàng)面到出血停止所經(jīng)時間作為止血時間。

2.3 數(shù)據(jù)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 艾納香葉殘渣中總黃酮的含量

5 份艾納香葉殘渣粉末樣品，按2.1 下的紫外分光光度法測得其的總黃酮平均含量為3.494%，RSD(%)為1.96。

3.2 小鼠足腫脹炎癥模型試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，艾納香葉水提液液和殘渣各極性部位成分均體現(xiàn)出不同強(qiáng)度的抗炎作用，其中以甲醇部位作用最為明顯，高劑量組效果接近陽性藥水平，低劑量組抑制率也有43.26%，且量效關(guān)系比較明確;水提部位效果也很明顯，高劑量組抑制率達(dá)到64.03%;石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位也具有一定的抗炎作用，但抑制率均未超過50%(見表1)。

表1 艾納香葉水提部位及殘渣不同部位對角叉菜膠致小鼠足腫脹度影響(，n=8)Table 1 The effect of different components fromBlumea balsamifera residues to mice swelling(x ±，n=8)

表1 艾納香葉水提部位及殘渣不同部位對角叉菜膠致小鼠足腫脹度影響(，n=8)Table 1 The effect of different components fromBlumea balsamifera residues to mice swelling(x ±，n=8)

注:與空白組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01(下表皆同)。Note:* P＜0.05，＊＊P＜0.01vs blank control group(below every tables like this).

3.3 炎癥組織中中PGE2含量及蛋白質(zhì)滲出量測定

PGE2含量測定試驗(yàn)中，葉殘渣的甲醇部位和水提液對于抑制炎癥組織中PGE2滲出效果均有顯著影響，其高劑量組均接近陽性藥水平。乙酸乙酯及正丁醇部位作用類似，但兩者作用均弱于甲醇部位。石油醚組均差于以上各組。

而蛋白質(zhì)滲出量測定試驗(yàn)中，藥渣的石油醚部位效果則最好，艾納香葉水提部位次之，其余各組效果類似，均對炎癥組織中蛋白質(zhì)的滲出有一定影響，但都不及陽性藥組(見表2)。

表2 艾納香葉水提部位及殘渣不同部位對炎癥組織中PGE2含量及蛋白質(zhì)滲出量影響(，n=8)Table 2 The effect of different components from Blumea balsamifera residues to the PGE2contents and protein transudation in the inflammation tissue (，n=8)

表2 艾納香葉水提部位及殘渣不同部位對炎癥組織中PGE2含量及蛋白質(zhì)滲出量影響(，n=8)Table 2 The effect of different components from Blumea balsamifera residues to the PGE2contents and protein transudation in the inflammation tissue (，n=8)

3.4 小鼠熱板鎮(zhèn)痛試驗(yàn)

熱板試驗(yàn)表明葉水提部位和殘渣的乙酸乙酯部位鎮(zhèn)痛作用類似且效果最佳，但其低劑量組幾乎沒有效果。甲醇組次之，但由于但劑量設(shè)置可能缺乏合理性，痛閾提高率和劑量沒有成一定的線性關(guān)系(見表3)。

表3 艾納香葉水提部位及殘渣部位對小鼠痛閾值(熱板試驗(yàn))影響(，n=8)Table 3 The effect of different components from Blumea balsamifera residues to the pain threshold of the mice (，n=8)

表3 艾納香葉水提部位及殘渣部位對小鼠痛閾值(熱板試驗(yàn))影響(，n=8)Table 3 The effect of different components from Blumea balsamifera residues to the pain threshold of the mice (，n=8)

3.5 小鼠剪尾止血試驗(yàn)

小鼠剪尾止血試驗(yàn)表明，艾納香葉殘渣的甲醇部位止血效果最為明顯，石油醚部位次之，其余各部位止血效果類似(見表4)。

表4 艾納香葉水提部位及殘渣不同部位對小鼠止血時間影響(，n=8)Table 4 The effect of different components from Blumea balsamifera residues to the hemostasis time of the mice (，n=8)

表4 艾納香葉水提部位及殘渣不同部位對小鼠止血時間影響(，n=8)Table 4 The effect of different components from Blumea balsamifera residues to the hemostasis time of the mice (，n=8)

4 討論與小結(jié)

由表1～表4 小鼠的足腫脹度、炎癥組織中PGE2含量及蛋白質(zhì)滲出量測定、熱板鎮(zhèn)痛及剪尾止血試驗(yàn)結(jié)果可見，艾納香葉的廢棄物均具有一定的鎮(zhèn)痛、抗炎、止血功效。綜合評價看來，艾納香葉水提部位在抗炎鎮(zhèn)痛方面均體現(xiàn)出良好的效果，只有在止血方面略遜一些。而殘渣甲醇部位在抗炎和止血功效上表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，而石油醚部位在抑制炎癥組織中蛋白質(zhì)的滲出作用最強(qiáng)，乙酸乙酯部位鎮(zhèn)痛效果最強(qiáng)。

艾納香廣泛分布于貴州等省區(qū)，已有悠久的種植歷史，作為貴州苗藥有較長的臨床應(yīng)用歷史，主治感冒、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、產(chǎn)后風(fēng)痛、痛經(jīng);外用治跌打損傷、瘡癤痛腫、濕疹、皮炎。有研究表明，艾納香中所含的黃酮類化合物與止血鎮(zhèn)痛、保肝抗癌等藥理作用相關(guān)［11、12］。本實(shí)驗(yàn)通過艾納香葉廢棄物中的總黃酮含量測定以及鎮(zhèn)痛抗炎止血等藥理研究，表明艾納香葉經(jīng)水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油和“艾粉”后的廢棄物中非揮發(fā)性化學(xué)成分具有很高的再研究利用價值。

綜上研究，艾納香葉提取揮發(fā)油之后的廢棄物在鎮(zhèn)痛、抗炎、止血方面均具有一定的藥理活性，具有良好的利用價值和綜合應(yīng)用前景。其鎮(zhèn)痛、抗炎、止血機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

1 Nanjing University of Chinese Medicine (南京中醫(yī)藥大學(xué)).Dictionary of Traditional Chinese Medicine(中藥大辭典).Shanghai:Science and Technology Press，2005.804.

2 Bai ZW(白志文)，Zhu L(朱露)，Sun JP(孫濟(jì)平)，et al.Research progress of Blumea balsamifera (L.)DC.Chin J Med (中國民族醫(yī)藥雜志)，2012，7:65-67.

3 Compiling group of the compilation of Chinese herbal medi-cine(全國中草藥匯編編寫組).The compilation of Chinese herbal medicine，Volume 1(全國中草藥匯編，上).Beijing:People＇s Medical Publishing House，1986.49.

4 Yang BL(楊本雷).China＇s yi medicine (中國彝族藥學(xué)).Kunming:Yunnan nationalities Press，2004.156.

5 Fu HC(傅紅專).Xuekang obstetrics gynecology medicine in the treatment efficacy of Blood.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2001，12 (2):147.

6 Zhang Y(張延)，Zhang Q(張芹)，Chen SX(陳毓秀).Women＇s blood Granules for drug efficacy of vaginalbleeding after abortion.Military Med Univ(武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報)，2002，12:122-123.

7 Zhang XJ(張曉金).Treatment of women Xuekang bleeding after abortion is not the net clinical research.Tradit Chin Med Clin Pharm(中藥新藥與臨床藥理)，2002，13:6-8.

8 Jiang XL(江興龍)，Pan JF(潘俊鋒)，Si J(司健)，et al.The Blumea balsamifera powder:Technical research of reaping and abstracting in plantation area.Biomass Chem Eng(生物質(zhì)化學(xué)工程)，2006，10:17-20.

9 Huang YL(黃永林)，Zhao ZG(趙志國)，Wen YX(文永新).Determination of total flavonoid in different sections of Blumea balsanifera.Guihaia (廣西植物)，2006，26:453-455.

10 Li YW(李勇文).Studies on the anti-inflammatory-immune and analgesic effects and their mechanisms of WWT Abstract.Guangxi:Guangxi Medical University(廣西醫(yī)科大學(xué))，MSc.2005.

11 Jiang JP(姜建萍)，Chen C(陳晨)，Lan RQ(藍(lán)仁青)，et al.The comparison of different extracts of Blumeariparia(Bl.)DC.on blood coagulation.Chin J ExpTradit Med Form(中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2010，16:104-106.

12 Xu SB(許實(shí)波)，Hu Y(胡瑩)，Lin YC(林永成)，et al.Study on protection of blumeatin against experimental liver injury and aggregation of platelet.Suppl J Sun Yat-Sen Univ(中山大學(xué)學(xué)報論叢)，1996，6:48-53.