聚磷菌—JN459的分離和聚磷特性研究

鐘傳青，姜天翼，王靜，張春明

（山東建筑大學市政與環境工程學院，山東 濟南250101）

0 引言

增強型生物除磷工藝EBPR（enhanced biological phosphorus removal）是目前普遍使用的生物除磷技術，除磷效率是普通生物除磷工藝的3～7倍［1－3］。EBPR工藝的基本原理為聚磷菌 PAOs（phosphate accumulation organisms）在厭氧／好氧交替環境中進行放磷和過量吸磷過程，然后通過排放污泥進行除磷。在厭氧階段 PAOs吸收揮發性脂肪酸 VFAs（volatile fatty acids）轉化為細胞內碳源 PHA（poly-βhydroxyalkanoates）并儲存起來；在好氧階段PAOs分解PHA，獲得的能量用于細胞生長和過量攝取磷元素，并以多聚磷酸鹽 Poly-P（Polyphosphate）的形式蓄積，最終活性污泥的含磷量可大于10%［4－7］。

PAOs是一類微生物的總稱，主要包括不動桿菌屬、紅環菌屬、氣單胞菌屬、棒桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬和放線菌綱等，還沒有證據證明哪類PAOs在 EBPR系統中占主導地位［8－10］。傳統定義的PAOs要求微生物具有兩個特征：（1）厭氧階段合成聚羥基烷PHAs（Poly-hydroxy-alkanoates）和好氧階段合成Poly-P；（2）厭氧和好氧階段交替過程中有Poly-P和PHAs相互的轉換。已有研究表明并不是所有聚磷微生物都有Poly-P和PHAs循環，目前對PAOs的定義更傾向于“一切能夠超過自身生長所需過量吸收磷的微生物”［11］。因此，闡明 PAOs種類、聚磷特性及各菌株在EBPR系統中的地位一直是生物除磷研究的重要方向。

文章從高新區污水處理廠活性污泥中分離到一株聚磷菌JN459，對其微生物學分類地位進行了鑒定，同時研究了該菌株在純培養條件下的聚磷特性，研究結果可為深入研究Microlunatus phosphovorus（M.phosphovous）聚磷代謝的分子調控機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

活性污泥來自濟南市高新區污水處理廠。

1.2 污水水質

市政污水來自濟南市高新區污水處理廠的進水，水質參數有：化學需氧量（COD）為 247 mg／L，氨態氮（NH4＋-N）為 63.3 mg／L，磷酸根（PO34-P）為13.5 mg／L。

人工合成污水成分為：葡萄糖為0.3 g、蛋白胨為 0.1 g、酵母粉為0.01 g、醋酸鈉為 0.15 g、氯化銨為 0.2 g、氯化鈉為 0.05 g、磷酸氫二鉀為 0.1 g、硫酸鎂為0.12 g、純化水為1 L。實測NH＋4-N為65.1 mg／L，PO3－4-P為14.2 mg／L。

1.3 SBR反應器

10 L體積的實驗室序列間歇式SBR（sequencing batch reactor）反應器（由小型發酵罐改裝），具備在線滅菌、在線溫度控制、在線pH檢測與溶解氧DO（Dissolved oxygen）檢測、空氣與氮氣流量控制等功能。

1.4 菌株的分離與篩選

取10 mL的活性污泥樣品，用40 mL的磷酸鹽溶液（5 mg／L的三聚磷酸鈉和8.5 g／L的氯化鈉）稀釋后均質，梯度稀釋后涂布到 R2YA培養基（0.5 g的酵母粉、0.5 g的蛋白胨、0.5 g的酪蛋白氨基酸、0.5 g的葡萄糖、0.5 g的可溶性淀粉、0.3 g的丙酸鈉、0.3 g的磷酸氫二鉀、0.03 g的硫酸鎂、20 g的瓊脂粉和1 L的純化水），在25℃溫度下培養，挑取單菌落。菌株形態、異染顆粒染色和生理生化特征測定根據文獻進行［12－13］。

1.5 16SrDNA分析

用LB液體培養基培養JN459菌株，提取該菌株總DNA，用高保真DNA聚合酶鏈式反應PCR（polymerase chain reaction）擴增其16SrDNA。將PCR產物連接到中間載體進行DNA測序，并將測序結果在GenBank中進行Blast比對，并與GenBank／EMBL／DDBJ中已知序列進行同源性分析。

1.6 菌株純培養和磷吸收試驗

將JN459株液體培養至對數生長期，離心收集菌體，并用無菌水洗滌，然后接種到SBR反應器中。吸磷和放磷試驗采用好氧－缺氧工藝，pH值控制為7.0，每個循環過程中好氧時間為2 h，溶解氧濃度約為4 mg／L；缺氧時間為2 h，用N2置換體系中O2，維持溶解氧濃度低于0.2 mg／L；最后，靜置時間為2 h，整個工藝維持約2 d，無菌體沉降和出水過程。每30 min取樣檢測水相中磷含量，每個試驗方案重復三次，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 JN459菌株的生理生化特征

通過單菌分離和純培養技術從活性污泥中分離得到一株球菌，編號為JN459。該菌最適生長溫度為25～30℃，最高耐受溫度40℃，最低生長溫度5℃；最適生長的pH值為7，最低的生長pH值為4，最高生長的 pH值為 9。JN459菌體直徑約1.5μm，顯微鏡觀察可見單個或2～4個菌體聚集，無運動性，革蘭氏染色陽性，亞甲基藍染色可見由Poly-P構成的異染顆粒。JN459為兼性好氧菌，過氧化氫酶呈陽性，但氧化酶活性較弱，在無氧條件下可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，不能利用亞硝酸鹽。JN459可以利用的碳源包括淀粉、L—山梨糖、D—阿拉伯糖、甘油、甘露醇、乙酸和絲氨酸，不能利用乳糖、丙酸、蘋果酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，結果見表1。

表1 JN459的生理生化特征

2.2 菌株JN459的16 S rDNA鑒定

16 S rDNA序列測序結果顯示，JN459菌株16 S rDNA的 PCR擴增片段長度為 1444 bp，與M.phosphovorus NM-1菌株的16 S rDNA僅有2個堿基不同，相似度達到 99.8%。JN459菌株 16 S rDNA的同源性分析如圖1所示。綜合其形態特征和生理生化鑒定試驗結果，確定JN459菌株為M.phosphovorus。M.phosphovorus是 1995年從EBPR系統分離得到的聚磷菌，具有顯著的聚磷效果，Poly-P可以達到其菌體干重的10%，熒光標記原位雜交技術 FISH（fluorescence in situ hybridization）分析結果顯示 M.phosphovorus占EBPR總 菌 群 2.7%，占 PAOs 9%［14－15］。但 是M.phosphovorus在厭氧階段無明顯釋磷現象，與其它PAOs好氧吸磷和厭氧釋磷的特點有顯著差異，提示M.phosphovorus在磷代謝途徑上存在獨特的調控機制。

圖1 基于JN459 16 S rDNA序列同源性的系統發育樹圖

2.3 JN459的聚磷特性

用SBR檢測好氧－缺氧工藝條件下JN459的吸磷和放磷曲線如圖2所示。由圖2可以看出，以人工合成污水為進水時，JN459在好氧階段攝取體系中大部分可溶性磷，除磷率可達93.7%，該結果與文獻中 M.phosphovorus的除磷效果相近［8］。在市政污水體系中JN459的除磷率為84.4%，這可能與市政污水中碳源成分比較復雜，不適合JN459菌株生長代謝有關。在缺氧階段初期，體系中溶解磷沒有明顯回升趨勢，說明JN459不具有PAOs可以大量分解PHA并釋放可溶性磷以維持菌株生長的顯著特征。當維持缺氧狀態至180 min時，人工污水和市政污水體系中溶解磷都小幅上升，在240 min時可溶性磷分別是缺氧階段初始值（120 min）的1.6和2.0倍。，說明 JN459可以分解 Poly-P并獲取能量，但相關酶系與轉運體系可能需要誘導并且表達水平較低［15－16］。

3 結論

通過本研究可知：

圖2 SBR工藝中JN459磷的吸收與釋放圖

（1）從市政污水處理廠活性污泥中分離到一株聚磷菌JN459，該菌株在好氧條件下可生成Poly-P的異染顆粒，經生理生化實驗及16 S rDNA分析，將JN459菌株鑒定為M.phosphovorus。M.phosphovorus是一種革蘭氏陽性球菌，在好氧條件下能夠積累Poly-P，而在厭氧階段通過分解Poly-P提供能量幫助細菌吸收有機物，M.phosphovorus不能合成糖原，因此Poly-P是厭氧階段能量的唯一來源，這與典型的PAOs不同。

（2）好氧條件下M.phosphovorus JN459菌株的除磷率達到93.7%，在缺氧條件下初期無明顯的Poly-P分解現象，經過較長時間的誘導后溶解磷含量會上升，說明磷代謝的酶系與轉運體系是可誘導的，該結果有助于深入研究M.phosphovorus JN459聚磷代謝的分子調控機制，為將其更好地應用到EBPR系統提供理論基礎。

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