受赤霉素調節的擬南芥F?box基因篩選分析

李 麗，劉德榮，李新梅，趙小英，劉選明（湖南大學生物學院，長沙410082）

doi：10.3969/j.issn.1672－5565.2015.03.02

受赤霉素調節的擬南芥F?box基因篩選分析

李 麗，劉德榮，李新梅，趙小英?，劉選明?
（湖南大學生物學院，長沙410082）

赤霉素（Gibberellins，GAs）作為一種植物激素，對植物的生長發育具有重要調控作用，但其作用機制有待進一步完善。F?box蛋白是SCF復合體的一個亞基，通過特異性識別底物來調控植物的生長發育。本研究采用生物信息學方法，通過分析擬南芥基因芯片數據庫提供的數據篩選到38個受GA調節的候選F?box基因，并對其中6個基因進行了實時熒光定量PCR驗證。PlantCARE分析顯示，其中30個基因的啟動子區具有GA響應元件、以及IAA、ABA、光、溫度干旱脅迫、或生物鐘相關的順式作用元件。通過分析BioGrid數據庫提供的相互作用對象，發現其中18個候選F?box蛋白與GA2ox1，GA3ox1和GA3ox3具有相互作用關系。基因表達譜分析表明，這些候選F?box基因在擬南芥各個組織器官中都有不同程度的表達，對IAA、ABA、光、溫度干旱等脅迫或不同光周期都具有一定的響應。為深入研究GA調控植物生長發育的分子機制提供了重要線索。

赤霉素；F?box基因；擬南芥；基因芯片

赤霉素（Gibberellins，GAs）是一類雙萜類植物激素，它在植物的各個生理學過程中起促進作用，包括種子的萌發、營養生長、開花以及各種生物和非生物脅迫響應等［1－4］。活性GAs的水平通常是受到嚴格調控的，并且在特定的作用位點積累來調控植物的生長發育［5－8］。目前就GAs合成途徑的研究比較詳細，它需要一系列酶的參與，其中關鍵酶GA20－氧化酶（GA20ox）和GA3－氧化酶（GA3ox）的豐度在很大程度上決定著活性GAs的水平，然而另一種關鍵酶GA2－氧化酶（GA2ox）能使活性GAs失活［9－12］。對于GA信號途徑，始于GA與其受體GID1（在擬南芥中有：GID1A，GID1B和GID1C）結合，然后促進GA－GID1－DELLA復合物的形成，進而啟動DELLA蛋白的泛素化降解，從而解除DELLA蛋白的生長抑制效應［13－15］。

SCF復合體是眾多E3泛素連接酶中的一種，其組成亞基之一，F?box蛋白能特異性識別底物，從而介導靶蛋白的降解［16］。在擬南芥中，當GA存在的情況下，F?box蛋白SLY1就通過與DELLA蛋白直接相互作用使其被泛素化降解，進而促進植物對GA的應答［17］。擬南芥基因組中約存在700多個F?box基因［18］，大多數F?box基因的功能尚不清楚。那么是否還存在其它更多的F?box基因參與到復雜的GA信號途徑中呢？

我們采用生物信息學方法，試圖挖掘擬南芥中受GA調節的F?box基因，分析這些候選F?box基因上游啟動子中的順式作用元件，組織器官表達譜、對各種環境因子如光、溫度、不同光周期等的響應表達譜，預測這些基因的編碼蛋白與GA合成代謝及信號途徑關鍵酶和蛋白因子之間的相互作用關系，為深入研究GA調控植物生長發育的分子機制提供重要線索和思路。

1 材料和方法

1.1 芯片數據下載

登錄NCBI的GEO數據庫（http://www.ncbi. nlm.ni h.gov/gds），以“Gibberellin”和“Arabidopsis”為關鍵詞檢索，分別下載登錄號（Accession）GSE29699，GSE35408，GSE39384，GSE6150和GSE7353等5組芯片數據。挑選芯片數據時，僅選取GA處理野生型擬南芥的數據，多種激素處理或GA處理突變體的芯片全部排除，以確保試驗的準確性。

1.2 芯片數據分析

利用RMAExpress將原始芯片數據標準化［19］，然后用自定義的perl程序篩選表達量有差異的基因。同時滿足下列條件的基因被認定受GA調節的候選F?box基因：（1）該基因的表達值大于或等于本組芯片所有表達值的25％分位值；（2）GA處理后該基因的表達量上調或下調1.4倍以上（P＜0.05）；（3）該基因的表達變化趨勢（升高或降低）至少在2組芯片中表現一致。

1.3 啟動子分析

從Tair網站（http://www.arabidopsis.org/）下載基因的啟動子（起始密碼子上游1 500 bp的序列），利用PlantCARE網站（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）提供的在線分析工具分析所有序列［20］，并統計和GA、IAA、ABA、光、溫度干旱脅迫及生物鐘相關的順式作用元件。

1.4 候選基因的表達譜和相互作用網絡分析

利用Genevestigator（http://genevestigator.com/gv/）分別分析候選F?box基因在不同激素（ABA、IAA）、光、溫度（冷、熱）、干旱、光周期和不同組織中的表達情況［21］。利用Cytoscape分析候選F?box基因編碼蛋白與GA合成代謝途徑及信號途徑關鍵酶和蛋白因子的相互作用情況［22］，分析過程僅以BioGrid數據庫提供的相互作用數據為對象［23］。由于整個相互作用網絡比較復雜，對GA與候選F?box蛋白建立連接沒有影響的其它蛋白已被移除。

1.5 GA處理

首先對擬南芥野生型Col－0種子進行表面消毒，即：用70％的乙醇消毒30s，然后加入1.5％的次氯酸鈉（NaClO），使種子完全淹沒其中，并不斷晃動確保消毒效率，10min后用無菌水將種子清洗5次。接著，將消毒后的種子播種于1/2MS培養基上，于4℃黑暗下低溫處理4d，然后轉到持續白光下生長，6d后，用50μmol的GA3噴灑幼苗，分別于0、0.5、1.5、3、6、9、12h后收集材料（GA處理前收集材料的時間點定為0h），在液氮中速凍，然后保存于－80℃，用于RNA分析。

1.6 實時熒光定量PCR分析

首先用RNAiso Plus試劑（Takara，Japan）提取材料中的總RNA，然后參照試劑盒提供的說明，用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，Japan）將RNA逆轉錄成單鏈cDNA。隨后，用SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（Takara，Japan）試劑盒進行實時熒光定量PCR分析。實時熒光定量PCR在Mx3000 Real?time PCR系統（Stratagene，The Netherlands）中進行，PCR程序為：95℃5min，95℃30 s，58℃20 s，72℃30 s，根據基因本底表達水平的差異，設計不同的循環數，一般為40個循環。PCR引物為：At1g23390（5′?AAG CTTCTCGATCTCTGTCCCG?3′和5′?ATCCCTCT TAGTTTCTCCAAATACG?3′）； At1g61340 （5′?GAG AGTCTTTGTTAATTCAGCGAGT?3′和 5′?ATGTG ACTGCTTTGCTATCATTGTA?3′）；At1g78280 （5′?GTGGTTGGTGGCACTGTATCCT?3′和5′?TCATC CGTGTCCTCTTCTCTTT?3′）；At3g61060（5′?ACGG GTCGTCTTTGTTTATCTATTT?3′ 和 5′?TCCTTCCAAGCCTCTTTGATGTTTT?3′）；At4g21510（5′?TCT CGACTTGAGTGTCTCCCTC?3′ 和 5′?GCTCTTTC CTCTTAGCCTTGGT?3′）；At5g50450 （5′?ACGCTC TTACCTCTCTCTGAAATC?3′ 和 5′?CCGACCCGA ACTAAACCACTCT?3′）；Actin2（5′?CACTGTGCCAA TCTACGAGGGT?3′和 5′?ACAAACGAGGGCTGG AACAAG?3′）。以擬南芥持家基因ACTIN2的表達水平作為內參計算待測基因的相對表達水平［24］。每一個數據代表三個重復試驗的平均值。

2 結果和分析

2.1 受GA調節的擬南芥F?box基因篩選及其啟動子分析

在擬南芥基因組中約存在700多個F?box基因，為了初步確定哪些F?box基因可能為GA途徑相關基因，我們首先采用生物信息學方法篩選受GA調節的 F?box基因。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/（GEO）網站中共下載了5組基因芯片，分別是 GSE29699，GSE35408，GSE39384，GSE6150和GSE7353，用RMAExpress將原始數據標準化，然后用自定義的perl程序進行數據分析，結果篩選到38個受GA調節（在P＜0.05時，上調或者下調1.4倍以上）的候選F?box基因（見表1）。隨后，對這38個基因起始密碼子上游1 500 bp啟動子序列進行分析，結果發現其中30個基因的上游啟動子區具有不同數量的GA響應元件GARE－motif（見表1），進一步說明這些基因可能是GA反應相關基因。此外，還發現這些基因的啟動子序列中具有光、激素、溫度和干旱脅迫、或光周期等環境因子響應元件（見表1）。

表1 38個候選F?box基因的統計Table 1 The statistics of 38 selected F?box genes

續（表1）

2.2 部分候選F?box基因表達鑒定

為了進一步確定芯片分析結果的可靠性，我們從中挑選了6個在芯片中表達量改變倍數較大的F?box基因進行實時熒光定量PCR鑒定，這些基因分別是At1g23390，At1g61340，At1g78280，At3g61060，At4g21510和At5g50450。芯片結果中（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE6150），在GA處理0.5 h時，At1g23390的表達水平下降2.2倍，隨著處理時間延長，在1 h和3 h時，其表達水平有所回升，而At1g61340的表達變化趨勢則相反，在GA處理0.5 h時的表達水平較對照上升了 4.7倍，然后隨著時間推移，逐漸下降；At1g78280和At3g61060對GA的反應相對較慢，GA處理1 h后，其表達水平才有顯著的升高，分別是對照的1.6倍和2.1倍，在3 h時，與對照相比，稍微有所降低；At5g50450則在GA處理0.5 h、1 h和3 h下，其mRNA水平逐漸升高。

實時熒光定量 PCR分析結果表明，這6個F?box基因對外源GA均有響應（見圖1），并且變化趨勢與芯片結果大體一致。例如，At1g23390和At1g61340對 GA的響應較迅速，在 GA處理后0.5 h就分別達到表達水平的最低值和峰值，分別下降和升高1.7倍和 1.9倍（見圖 1a，b）；At1g78280和At3g61060在GA處理6 h時，其表達水平較對照分別降低了1.47和1.69倍（見圖1c，d）。進一步證實了篩選結果的可靠性。

圖1 外源GA3處理對6個候選F?box基因表達的影響Fig.1 The effect of exogenous GA3treatment on themRNA expression of 6 candidate F?box genes

2.3 候選F?box蛋白與GA途徑關鍵蛋白的相互作用網絡分析

為了進一步分析候選F?box基因與GA的關系，我們利用BioGrid數據庫中提供的相互作用對象，用Cytoscape軟件分析38個候選F?box蛋白與GA途徑關鍵酶和蛋白因子（GA20ox、GA3ox、GA2ox、GID1和DELLA）之間是否存在直接或間接相互作用關系。結果發現F?box蛋白At1g68050（FKF1）與GA2ox1和GA3ox3具有相互作用關系，其它17個F?box蛋白（圖2中粗線框標記部分）通過SCF復合體組成亞基Skp1相關蛋白Skp1 HOMELOGUE 1、Skp1?like2和At1g22920與GA2ox1、GA3ox1和GA3ox3蛋白間有關聯（見圖2），表明這18個F?box基因可能參與調控GA的合成和代謝。

2.4 候選F?box基因的表達譜分析

2.4.1 不同組織器官中的表達譜分析

由于GAs通常是在植物特定的功能部位積累并發揮作用［5－8］，因此我們對候選的38個F?box基因在擬南芥不同組織器官中的表達情況進行了分析。從圖3中可以看出，At1g78100、At2g41170和At3g08810這3個基因在所有組織中的表達都是極其低的，At1g47790和At3g49510只在果莢中表達較高，可能參與調控果莢及種子的發育；At3g20710和At5g60610只在雄蕊中有一定量的表達，可能參與花和雄蕊的發育；其它F?box基因的表達則相對廣泛，在擬南芥幼苗、下胚軸、花、果莢和根中都有不同程度的表達，表明這些基因可能參與了植物整個生長發育過程的調控。

2.4.2 不同激素、光、溫度和干旱脅迫及不同光周期下的表達譜分析

圖3 候選F?box基因在擬南芥不同組織中的表達譜Fig.3 The expression profile of candidate F?box genes in different tissues of Arabidopsis

由于其它激素，如生長素可以調控GAs的合成［1］，且激素之間通常可以形成復雜的交叉調控網絡，同時GA也可以將環境信號如光、非生物脅迫及光周期等信號進行整合，進而調控植物的生長發育，從而使植物適應外界環境的變化［25－30］。因此，我們利用Genevestigator分析了38個候選F?box基因響應IAA、ABA、光、溫度和干旱脅迫及不同光周期的表達譜。

從圖4中可看出，大部分F?box基因對這些環境因子及激素都有一定的響應，其中對環境因子的應答較強烈。具體而言，在上述因子分別作用下其表達水平上調或下調超過2倍（P＜0.05）的F?box基因有，激素 （ABA、IAA）處理下：At1g10780，At1g21410， At1g80440， At3g23880， At3g61060，At5g06550；不同光下：At1g23390，At1g80440；光周期影 響 下： At1g15670， At1g23390， At1g61340，At1g63090， At1g78100， At1g80440， At2g44130，At3g23880，At3g61060，At4g21510；脅迫影響下：At1g10780， At1g15670， At1g21410， At1g23390，At1g61340，At1g80440，At3g61060。綜合而言，對各種環境因子都響應顯著的基因為：At1g23390和At1g80440，這2個基因可能通過GA信號通路，參與激素間的交叉會話以及植物對環境因子的響應。

圖4 候選F?box基因在不同激素或環境因子影響下的表達譜Fig.4 The expression profile of candidate F?box genes under different environment factors or hormones

3 討 論

本研究通過基因芯片分析，總共篩選到表達水平受GA上調或下調1.4倍以上的F?box基因38個。通過對這38個基因上游1 500 bp啟動子區分析，發現其中30個基因都具有GA響應元件GARE?motif，以及其它激素或者環境因子響應元件，如IAA、ABA、光、生物鐘或溫度及干旱等響應元件，表明這些基因可能在GA信號通路以及植物對外界環境變化的響應中起重要作用。

從38個基因中挑選了6個在芯片分析結果中表達量改變較大的基因進行了實時熒光定量PCR鑒定，證實這6個基因對外源GA均有不同程度的響應，并且與芯片結果大體一致。此外，通過對BioGrid數據庫中提供的相互作用對象分析，發現一些候選 F?box蛋白與 GA合成代謝途徑關鍵酶GA3ox1、GA3ox3和GA2ox1具有一定的相互作用關系，但是在植物體內是否存在相互作用，是間接互作還是直接互作，還有待進一步驗證。

植物體內GAs的水平受到嚴格調控并且在特定的功能位點積累進而調控植物的生長發育［5－8］。通過對38個候選F?box基因的表達譜分析，發現大部分基因在擬南芥幼苗、下胚軸、花和根中有不同程度的表達，而這些部位的生長發育也受到GA的調控［1－4］。GAs不僅直接調控植物的生長發育，還能通過對環境信號，如光、溫度和干旱等非生物脅迫及生物鐘等進行整合進而對植物的生長發育進行調控［25－30］。本研究篩選到的受GA調節的部分候選F?box基因對不同光、光周期及脅迫具有很強的響應，同時對激素ABA和IAA也有不同程度的應答。推測這些基因可能通過GA信號通路參與植物生長發育，以及植物對環境因子的響應。

總之，通過生物信息學方法，我們篩選到了一系列響應GA的F?box基因，并可能通過GA信號通路參與植物對環境因子的應答。因此，本研究結果為我們今后深入研究GA調控植物生長發育的分子機制提供了重要線索。

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Screening and analysis of gibberellin?regulated F?box genes in Arabidopsis

LI li，LIU Derong，LIXinmei，ZHAO Xiaoying?，LIU Xuanming?
（College ofBiology，Hunan University，Changsha 410082，China）

Gibberellins（GAs）act as one plant hormone，which play an important role in the regulation of plant growth and development，but themolecularmechanism for GA?mediated plant growth regulation remains to be perfect further.F?box proteins are the subunits of SCF complex and also control the plant growth and development via the specific recognition of substrates.In this study，38 candidate F?box genes regulated by GA were selected through the analysis of genemicroarray data in Arabidopsis using bioinformaticsmethods，and six ofwhich were verified by real?time PCR.Furthermore，Plant CARE results show that there are thirty F?box genes with GA response elements and other elements involved in IAA，ABA，light，temperature and drought stresses or circadian clock in the promoter sequence.Besides，the analysis of interactions of proteins provided by BioGrid databases show thateighteen candidate F?box proteins have director indirect correlation with GA2ox1，GA3ox1 and GA3ox3.The gene expression profiles tell us that the candidate F?box genes express at all tissues and organs in Arabidopsis，and have responses to IAA，ABA，light，temperature and drought stresses，or photoperiod.Our results in this paper provide important clues for further study themolecularmechanism of plant growth and development regulated by GAs.

GA；F?box gene；Arabidopsis；Genemicroarray

Q343.1

A

1672－5565（2015）03－150－08

2015－04－03；

2015－05－04.

國家自然科學基金項目（No：31171176）；湖南省自然科學基金項目（No：11JJA002）。

李麗，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學；E?mail：957800401＠qq.com.

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趙小英，女，教授，碩導，研究方向：植物赤霉素和光信號轉導；E?mail：zxy＿mm＠163.com；

劉選明，男，教授，博導，研究方向：植物功能基因組學、植物發育分子生物學、生物質再生能源等；E?mail：xml05＠126.com.