王不留行黃酮苷軟膏劑的制備工藝研究

侯 豹，馮 磊，王 旭，劉艷玲，蔡維維，邱麗穎*

1 江南大學(xué)藥學(xué)院天然藥物研究室;2江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，無(wú)錫 214122

王不留行(Vaccaria segetalis)為雙子葉植物石竹科麥藍(lán)菜的干燥成熟種子［1］，為常見(jiàn)中藥，具有下乳消腫、活血通經(jīng)功效［2］。主要含有三萜皂苷、黃酮苷、環(huán)肽、類脂和脂肪酸等成分，王不留行黃酮苷為一種黃酮糖苷，為淡黃色顆粒結(jié)晶，易溶于甲醇、水、甲醇-水［3］。

研究表明王不留行黃酮苷具有促內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用［4］，可以加快開(kāi)放性創(chuàng)傷的愈合速度，可用來(lái)治療糖尿病足、凍傷、皸裂和機(jī)械創(chuàng)傷等開(kāi)放性創(chuàng)傷［5］。因此，本研究擬開(kāi)發(fā)王不留行黃酮苷軟膏劑，用于治療開(kāi)放性創(chuàng)傷，方便病人使用。現(xiàn)對(duì)王不留行黃酮苷軟膏劑的處方、制備工藝及制劑穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，以制得性質(zhì)穩(wěn)定的王不留行黃酮苷軟膏劑，拓寬王不留行黃酮苷的應(yīng)用前景，更充分的開(kāi)發(fā)王不留行黃酮苷的藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

王不留行黃酮苷標(biāo)準(zhǔn)品(上海士峰生物科技公司)。硬脂酸、十二烷基硫酸鈉、單硬脂酸甘油酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、十八醇、甘油、液狀石蠟、凡士林均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，配2489 UV檢測(cè)器及Empower Pro 色譜數(shù)據(jù)工作站(美國(guó)Waters 公司)，STARTER 3100 pH 計(jì)，NDJ-1 旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，AL104 型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，TDZ4A 型臺(tái)式離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 王不留行黃酮苷軟膏劑的制備方法

首先將王不留行黃酮苷研細(xì)后過(guò)60 目篩備用，然后取硬脂酸甘油酯、液狀石蠟、硬脂酸和十八醇加熱融化為油相。另取純甘油和蒸餾水加熱至90 ℃，再加入十二烷基硫酸鈉和羥苯乙酯融化為水相，將水相緩緩倒入油相中，邊加邊攪拌，直至冷凝即得O/W 乳劑。隨后將過(guò)篩以后的王不留行黃酮苷以0.1%用量加入至此乳劑中，攪勻即得王不留行黃酮苷軟膏劑［6］。

1.3.2 王不留行黃酮苷軟膏劑外觀性狀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

軟膏劑應(yīng)均勻、細(xì)膩、具有適當(dāng)?shù)恼吵硇裕送坎加谄つw或黏膜上并且無(wú)刺激。

均勻性是指取軟膏約1 g，置于表面光潔的玻璃板中間，小心再蓋上同樣大小的玻璃板(不要帶入氣泡)，用夾子夾緊四周，對(duì)著日光觀察，應(yīng)無(wú)顆粒狀，色澤均勻、細(xì)膩。

1.3.3 王不留行黃酮苷軟膏劑的穩(wěn)定性檢查

將軟膏裝入帶塞試管中，分別于55 ℃恒溫放置6 h 與零下15 ℃恒溫放置24 h，觀察應(yīng)無(wú)液化、粗化、分層等現(xiàn)象。將軟膏置于10 mL 離心管中，離心30 min(3000 rpm)應(yīng)無(wú)分層現(xiàn)象。

1.3.4 王不留行黃酮苷軟膏劑pH 測(cè)定

將1 g 軟膏稀釋至10 g 去離子水中，然后用STARTER 3100 pH 計(jì)測(cè)定其pH 值。

根據(jù)中國(guó)藥典二部附錄ⅥH 規(guī)定的乳劑型基質(zhì)PH 要求，W/O 型乳劑基質(zhì)pH 應(yīng)不大于8.5、O/W型乳劑基質(zhì)pH 應(yīng)不大于8.3，但作為開(kāi)放性創(chuàng)傷的軟膏劑其基質(zhì)pH 值應(yīng)該在人體組織液pH 值(7.0～7.4)范圍內(nèi)，所以下面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行軟膏劑配方篩選pH 值應(yīng)在(7.0～7.4)范圍內(nèi)。

1.3.5 王不留行黃酮苷軟膏劑粘度測(cè)定

本研究使用NDJ-1 旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，檢測(cè)軟膏劑的粘度。由于王不留行黃酮苷軟膏劑是用于體表的涂抹，所以其適宜粘度應(yīng)在102～105mpas 范圍內(nèi)。

1.3.6 王不留行黃酮苷軟膏劑中黃酮苷的含量測(cè)定

1.3.6.1 對(duì)照品溶液制備

取王不留行黃酮苷對(duì)照品20 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，用70%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液;再分別量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，配制成濃度依次為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/mL 的溶液備用。

1.3.6.2 供試品溶液制備

精密稱取王不留行黃酮苷軟膏2.0 g 至100 mL量瓶中，加入甲醇適量，60 ℃超聲20 min 使其溶解，放冷后加入甲醇稀釋至刻度過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.6.3 色譜條件

色譜柱為Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸溶液;流速為0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.6.4 含量測(cè)定

分別在軟膏制備后1 天和2 個(gè)月時(shí)間點(diǎn)精密稱取3 批次王不留行黃酮苷軟膏，依法制備供試品溶液按照上述色譜條件進(jìn)樣、測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 王不留行黃酮苷軟膏劑處方篩選

2.1.1 王不留行黃酮苷軟膏劑三元油相組成的篩選

在篩選三元油相種類時(shí)，選擇水相:15%純甘油和40%蒸餾水，乳化劑:2%十二烷基硫酸鈉和15%硬脂酸甘油酯，防腐劑:0.1%羥苯乙酯。然后從液體石蠟、硬脂酸、蜂蠟、十八醇四種油相中篩選出一組較佳的油相配方，按2.1 軟膏劑的制備方法制備。然后按上述軟膏劑的檢測(cè)方法檢測(cè)軟膏劑的各項(xiàng)指標(biāo)。

由表1 所給出的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果，可知液體石蠟:蜂蠟:十八醇為(5∶1∶1)時(shí)軟膏劑的pH 值稍微偏大，不符合要求。液體石蠟:硬脂酸:蜂蠟為(5∶1∶1)和液體石蠟:硬脂酸:十八醇為(5∶1∶1)時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)皆符合要求。但考慮到十八醇在軟膏劑的制備過(guò)程中處理較方便，比蜂蠟廉價(jià)、易得等優(yōu)點(diǎn)，故選取液體石蠟、硬脂酸和十八醇作為三元油相輔料。

表1 三元油相種類的篩選實(shí)驗(yàn)Table 1 Screening of different ternary oil phases

2.1.2 王不留行黃酮苷軟膏劑三元油相配比的篩選

在篩選三元油相配比時(shí)，選擇水相:15%純甘油和40%蒸餾水，乳化劑:2%十二烷基硫酸鈉和15%硬脂酸甘油酯，防腐劑:0.1%羥苯乙酯。然后改變?nèi)拖嘁后w石蠟、硬脂酸和十八醇的配比，按2.1軟膏劑的制備方法制備。然后按上述軟膏劑的檢測(cè)方法檢測(cè)軟膏劑的各項(xiàng)指標(biāo)。

表2 三元油相配比的篩選實(shí)驗(yàn)Table 2 Comparison of different ternary oil phase ratios

由表2 所給出的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果，可知液體石蠟∶硬脂酸∶十八醇為(5∶2∶1)和(5∶3∶1)時(shí)軟膏劑的pH 值稍微偏低，不符合要求。液體石蠟∶硬脂酸∶十八醇為(5∶1∶3)、(5∶1∶2)和(5∶1∶1)時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)皆符合要求且無(wú)明顯差別。但十八醇價(jià)廉易得，且當(dāng)液體石蠟∶硬脂酸∶十八醇為(5∶1∶3)時(shí)軟膏劑黏度較小適宜開(kāi)放性創(chuàng)傷的涂抹。故選取石蠟∶硬脂酸∶十八醇為(5∶1∶3)作為三元油相的配比。

2.1.3 王不留行黃酮苷軟膏劑二元水相配比的篩選

在篩選二元水相配比時(shí)，選擇油相:20%液體石蠟、2%硬脂酸和6%十八醇，乳化劑:2%十二烷基硫酸鈉和15%硬脂酸甘油酯，防腐劑:0.1%羥苯乙酯。然后改變二元水相純甘油與蒸餾水的配比，按2.1 軟膏劑的制備方法制備。然后按上述軟膏劑的檢測(cè)方法檢測(cè)軟膏劑的各項(xiàng)指標(biāo)。

表3 二元水相配比的篩選實(shí)驗(yàn)Table 3 Comparison of different dual water phase ratios

由表3 所給出各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果，可知純甘油:蒸餾水為(6∶5)、(7∶4)和(8∶3)時(shí)軟膏劑的pH 值稍微偏低，不符合要求。純甘油:蒸餾水為(3∶8)、(4∶7)和(5∶6)時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)皆符合要求且無(wú)明顯差別。但是考慮到本品為王不留行黃酮苷軟膏劑，其中的王不留行黃酮苷可溶于水，并且水量越多越容易分解而降低藥效。故蒸餾水的用量越少越好，所以選取純甘油:蒸餾水為(5∶6)作為二元水相配比。

2.1.4 王不留行黃酮苷軟膏劑油相與水相配比篩選

在篩選油相與水相的配比時(shí)，選擇油相:液體石蠟、硬脂酸和十八醇的配比為(5∶1∶3)，水相:純甘油和蒸餾水的配比為(5∶6)，乳化劑:2%十二烷基硫酸鈉和15%硬脂酸甘油酯，防腐劑:0.1%羥苯乙酯。然后改變油相與水相的配比，按2.1 軟膏劑的制備方法制備。然后按上述軟膏劑的檢測(cè)方法檢測(cè)軟膏劑的各項(xiàng)指標(biāo)。

由表4 所給出各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果，可知油相:水相為(1∶1)、(2∶1)和(3∶1)時(shí)軟膏劑的外觀不均勻、穩(wěn)定性較差，不符合要求。油相:水相為(1∶3)和(1∶2)軟膏劑的各項(xiàng)指標(biāo)皆符合要求且無(wú)明顯差別。但是考慮到本品為王不留行黃酮苷軟膏劑，其中的王不留行黃酮苷可溶于水，并且水量越多越容易分解而降低藥效。故水相的用量越少越好，所以選取油相:水相為(1∶2)作為油相與水相的配比。

表4 油相與水相配比篩選實(shí)驗(yàn)Table 4 The screening experiment of oil and water phase ratio

2.1.5 在軟膏劑基質(zhì)中加入王不留行黃酮苷后平行三組實(shí)驗(yàn)其指標(biāo)列表

在檢測(cè)在軟膏劑基質(zhì)中加入王不留行黃酮苷后其各項(xiàng)指標(biāo)時(shí)，平行制備三批次軟膏，按實(shí)施例1 中軟膏劑的制備方法。將王不留行黃酮苷研細(xì)后過(guò)60 目篩備用，取15%硬脂酸甘油酯(15%為硬脂酸甘油酯在軟膏劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，且以下試劑的用量皆為質(zhì)量分?jǐn)?shù))、20%液狀石蠟、2%硬脂酸和6%十八醇加熱融化為油相。另取25%純甘油和30%蒸餾水加熱至90 ℃，再加入2%十二烷基硫酸鈉和0.1%羥苯乙酯溶解為水相。然后將水相緩緩倒入油相中，邊加邊攪拌，直至冷凝即得O/W 乳劑。隨后將過(guò)篩以后的王不留行黃酮苷以0.1%用量加入至此乳劑中，攪勻即得王不留行黃酮苷軟膏劑。然后按上述軟膏劑的檢測(cè)方法檢測(cè)軟膏劑的各項(xiàng)指標(biāo)。

表5 在軟膏劑基質(zhì)中加入王不留行黃酮苷后平行三組實(shí)驗(yàn)Table 5 Three parallel experiments of adding V.segetalis flavonoid glycosides into ointments matrix

由表5 所給出各組軟膏劑各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果，可知各組軟膏劑的各項(xiàng)指標(biāo)皆符合實(shí)施例1 中軟膏劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，且批次間差異較小。故本發(fā)明研究出的這種王不留行黃酮苷軟膏劑的制備方法，制備出的軟膏劑工藝穩(wěn)定重復(fù)性好符合軟膏劑制備標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 王不留行黃酮苷軟膏劑中黃酮苷含量的測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系考察

按照1.3.6.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)濃度X 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到如下回歸方程:Y=2.2E+7X+5452.4，r2=0.9997。結(jié)果表明:王不留行黃酮苷在0.005～0.100 mg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.2 黃酮苷含量測(cè)定

分別在軟膏制備后1 天和2 個(gè)月時(shí)間點(diǎn)精密稱取3 批次王不留行黃酮苷軟膏，依法制備供試品溶液按照上述色譜條件進(jìn)樣、測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 王不留行黃酮苷含量測(cè)定結(jié)果Table 6 Content determination results of V.segetalis flavonoid glycosides in ointments

圖1 王不留行黃酮苷標(biāo)準(zhǔn)品(A)及供試品(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of vaccarin standard(A)and ointment sample(B)

3 討論與結(jié)論

王不留行黃酮苷易溶于水，但是水量過(guò)多時(shí)又容易分解，因此水相的用量在制備工藝篩選過(guò)程中屬于研究重點(diǎn)。軟膏劑的外觀和黏度在研究過(guò)程中差異不明顯，均應(yīng)符合中國(guó)藥典要求。本研究采用多因素配比實(shí)驗(yàn)篩選軟膏劑處方，并采用十二烷基硫酸鈉和硬脂酸甘油酯分別作為水相和油相乳化劑協(xié)同作用，成功制備王不留行黃酮苷軟膏，外觀細(xì)膩光滑，穩(wěn)定性良好。該工藝簡(jiǎn)單、可行，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控，拓寬了王不留行黃酮苷的應(yīng)用前景，同時(shí)也拓寬了開(kāi)放性創(chuàng)傷的治愈渠道。

在王不留行黃酮苷含量測(cè)定過(guò)程中，因?yàn)橛杏湍拇嬖冢┰嚻啡芤旱亩ㄈ菘赡艽嬖谡`差，導(dǎo)致王不留行黃酮苷的含量偏高，但測(cè)定結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。本研究參考了中國(guó)藥典中王不留行黃酮苷的HPLC測(cè)定方法。經(jīng)方法學(xué)考察，表明該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 Chinese Pharmacopoeia(國(guó)家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeiaof People’s Republic of China(中華人民共和國(guó)藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，49-51.

2 Meng H(孟賀)，Chen YP(陳玉平)，Qin WJ(秦文杰)，et al.Cowherb seed medium yellow ketone glucoside of separation and identification.China Tradit Herb Drug(中草藥)，2011，42:874-876.

3 Lu YH(盧艷花)，Zhu EY(朱恩圓)，Chen ZG(陳昭桂)，et al.Extraction and Separation of Chinese Medicine Effective Component Instance.Beijing.Chemical Industry Press，2007，Vol I，49-51.

4 Xie FS，Cai WW，Liu YL，et al.Vaccarin attenuates human EA·hy926 endothelial cells oxidative stress injury through Notch signaling inhibition.Int J Molec Med，2015，35:135-142.

5 Han J(韓晉)，Li N(李娜)，Liu D(劉冬)，et al.Compound Ganoderma lucidum cream of rabbit ears Frostbite slightly the preliminary research on the therapeutic effect.Pharm J China(中國(guó)藥學(xué)雜志)，2012，9:689-692.

6 Cui FD(崔福德)，Lv WL(呂萬(wàn)良)，Lu B(陸斌)，et al.Pharmacy.Beijing:People＇s Medical Publishing House(人民衛(wèi)生出版社)，2007，Vol VI，40-41.