響應面法對青稞紅曲中兩種Monacolin K 的提取工藝優化

譚友莉，馬云桐，黃 鳳，文 靜，余志芳，歐 泉

成都中醫藥大學藥學院 四川省中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 611137

青稞紅曲是紅曲霉屬真菌接種于青稞上發酵而成的一種麥曲。其含有的Monacolin K(即洛伐他汀)成分是對3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMGCoA)還原酶起抑制作用的物質［1］，具有降血壓、降血脂、減少動脈粥樣硬化發生、防治冠心病等作用［2，3］。在紅曲中Monacolin K 以開環的酸型和內酯型兩種形態存在［4］。據研究發現酸型Monacolin K 因能被人體直接吸收，發揮降脂作用，減少了肝、腎負擔，而優于需在體內水解轉化為開環型發揮藥效的內酯型Monacolin K［5］。因此，有效提取青稞紅曲中Monacolin K，并準確測定其兩種形態的含量和比例，對開發該藥物資源和體現其降脂作用具有重要意義。本文采用超聲提取法，用響應面法對主要影響因子提取時間、溫度和料液比之間的單一和交互作用等進行了較深入的研究，得出最佳提取青稞紅曲中Monacolin K 的工藝參數，并采用HPLC 法同時測定內酯型和酸型Monacolin K 的含量及比例，為青稞紅曲中Monacolin K 的開發利用提供理論依據。

圖1 酸型和內酯型Monacolin K 的化學結構Fig.1 Chemical structures of acid form and lactone form of Monacolin K

1 材料與儀器

1.1 材料

青稞紅曲(批號:20140605):由西藏月王生物技術有限公司提供。甲醇、乙腈為色譜純［賽默飛世爾科技(中國)有限公司］，磷酸、氫氧化鈉為分析純(成都市科龍化工試劑廠)，內酯型Monacolin K標準品(C24H36O50，99.4%，批號:100600- 201003;中國食品藥品檢定研究院)。

1.2 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀(G1322A 溶劑脫氣器，G1311A 四元泵，G1315C 二極管陣列檢測器);十萬分之一天平［賽多利斯科學儀器(北京)有限公司］;JA1003 千分之一天平(上海舜宇平科學儀器有限公司);KQ5200E 超聲清洗器機(昆山市超聲儀器有限公司);DZKW-4 電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫:30 ℃，流動相:乙腈-0.1%磷酸水(60∶40，v/v)，流速1.0 mL/min，檢測波長:238 nm，參比波長(400 nm)，進樣量:10 μL，樣品經0.45 μm 濾膜過濾后用HPLC 法測定。

2.2 對照品溶液及樣品溶液的制備

2.2.1 內酯型Monacolin K 對照品

精密稱定Monacolin K(內酯)標準品10.18 mg加入甲醇定容至100 mL，搖勻，作為內酯型洛伐他汀對照品溶液。HPLC 檢測內酯型洛伐他汀保留時間在15.862 min。

2.2.2 酸型Monacolin K 對照品

稱取Monacolin K(內酯)標準品20.10 mg，用含20%甲醇pH=12 的氫氧化鈉溶液定容至100 mL，在50 ℃條件下超聲轉化1 h 自然冷卻至室溫。HPLC 檢測發現轉換后的酸型Monacolin K 只有一個峰，保留時間在8.673 min。

2.2.3 樣品溶液的制備

取青稞紅曲粉末(過三號篩)約1.0 g，精密稱定，置100 mL 磨口錐形瓶，加20 mL 純甲醇，稱定重量，50 ℃超聲提取1 h，放冷，再稱定重量，用純甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，4 ℃冰箱儲存備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍

精密吸取0.2010 mg/mL 酸型和0.1018 mg/mL內酯型Monacolin K 對照品溶液2、5、10、15、20 μL，每個濃度進樣3 次。以峰面積為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程:內酯型Monacolin K:Y=78.137X-26.171，相關系數r=0.9999;酸型Monacolin K:Y=25.484X+2.3171，相關系數r=0.9998。表明酸型Monacolin K 在40～300 mg/L 和內酯型Monacolin K 在10～200 mg/L范圍內線性關系良好。

2.3.2 分離度實驗

精密吸取2.2 項樣品溶液和對照品溶液，按照2.1 項下色譜條件分別進樣，如圖2，在樣品中兩種Monacolin K 出峰時間和兩種Monacolin K 標準品出峰時間吻合。在樣品中內酯型Monacolin K 和酸型Monacolin K 分離度良好，且需要的色譜峰附近不存在干擾峰，兩種類型Monacolin K 分離情況如下圖2所示。

圖2 樣品中酸型和內酯型Monacolin K 的分離圖Fig.2 HPLC chromatogram of highland barley Monascus

2.3.3 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液，按上述2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，記錄酸型Monacolin K 和內酯型Monacolin K 峰面積，結果酸型和內酯型Monacolin K 峰面積的RSD 分別為0.63%、0.82%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗

按2.2.3 項重復制備6 份同一供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，計算，得酸型Monacolin K平均含量為0.26%，RSD 為0.53%，內酯型Monacolin K 平均含量為0.15%，RSD 為1.26%。結果說明，該檢測條件重復性良好，滿足樣品檢測的需要。

2.3.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在1、4、8、12、16、24 h進樣，記錄酸型和內酯型Monacolin K 峰面積，結果酸型Monacolin K RSD 為0.83%，內酯型Monacolin K RSD 為1.12%，表明在24 h 內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

取已知含量青稞紅曲樣品6 份，加入一定量酸型和內酯型Monacolin K 標準液進行回收試驗。酸型Monacolin K 的平均回收率為99.6%，RSD 為0.24%;內酯型Monacolin K 的平均回收率為98.4%，RSD 為0.71%。

2.4 兩種Monacolin K 提取單因素試驗設計

在進行響應面分析之前，先通過單因素實驗選出對青稞紅曲中兩種Monacolin K 提取得率具有顯著影響的因素，并確定其試驗水平。本文稱取1.0 g青稞紅曲，考察不同濃度甲醇(45%、55%、65%、75%、85%、100%)，提取溫度(40、50、60、70、80℃)，提取時間(10、30、60、90、120 min)，液固比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)對青稞紅曲中兩種Monacolin K 提取得率的影響。

2.5 兩種Monacolin K 提取響應面法實驗設計與數據分析方法

以單因素試驗的結果為基礎，根據Box-Behnken試驗設計原理，選取提取溫度(A)、液固比(B)、提取時間(C)等對兩種Monacolin K 提取影響顯著的3個因素，在單因素試驗的基礎上采用3 因素3 水平的響應面分析方法。具體試驗因素與水平設計方案見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

采用Design-Expert 8.0 軟件對實驗數據進行回歸分析，擬合二次多項式方程。多項式模型方程擬合可靠性R2越接近1，則多項式模型與實際擬合可靠性越高，其統計學上的顯著性由F 值檢驗，F 值越大表明該變量對因變量的影響越顯著;因素的線性效應、平方效應及其交互效應的顯著性由模型系數的P 值檢驗，概率P 值越小，則相應的顯著程度越高，P＜0.01 時影響為極顯著，P＜0.05 影響顯著。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 提取溶劑對青稞紅曲中兩種Monacolin K 得率的影響

設定提取溫度50 ℃，液固比20∶1 mL/g，超聲提取2 h，分別以45%、55%、65%、75%、85%、100%不同濃度甲醇作為提取溶劑，測定兩種Monacolin K 的峰面積。結果表明，甲醇濃度越高兩種Monacolin K 提取得率越高。使用純甲醇提取溶液所得的酸型Monacolin K 的平均得率為0.233%;內酯型Monacolin K 平均得率為0.153%。采用純甲醇提取樣品，色素含量低，能保護柱子;不需要蒸干溶劑再定容，過濾容易;因不含水，酸型和內酯型Monacolin K 穩定性更好，含量更確定可靠。故采用純甲醇提取青稞紅曲種兩種Monacolin K。

3.1.2 提取溫度對青稞紅曲中兩種Monacolin K 的得率的影響

設定純甲醇為提取溶劑，液固比為20∶1 mL/g，超聲提取時間為2 h 條件下，在40、50、60、70、80℃溫度下，分別測定兩種Monacolin K 的峰面積，結果表明在60 ℃左右時，兩種Monacolin K 的得率達到最值。因此選擇溫度為60 ℃左右為宜。

圖3 提取溫度對得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction yield of Monacolin K

3.1.3 液固比對青稞紅曲中Monacolin K 的得率的影響

設定在60 ℃下，純甲醇為提取溶劑，超聲提取時間為2 h，以10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g)液固比，分別測定兩種Monacolin K 的峰面積，結果表明液固比為20∶1 mL/g 附近時兩種Monacolin K的得率達到最值之后提取得率略有下降。因此液固比選擇在20∶1 mL/g 左右。

由于不帶蓄電池備電，所以在沒有市電的情況下，這種供電方式不能為信號源提供電能。綜上所述，直流輸入不帶備電的方案比較適合于信號源為直流輸入，對服務要求不高的場景。

圖4 液固比對得率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction yield of Monacolin K

3.1.4 超聲提取時間對青稞紅曲中Monacolin K 的得率的影響

設定60 ℃下，以純甲醇為提取溶劑，液固比20∶1 mL/g，分別提取10、30、60、90、120 min，分別測定兩種Monacolin K 的峰面積，結果表明，兩種Monacolin K 得率隨時間的增長呈上升趨勢，60 min 附近達到最大之后趨于平緩，為減少能耗，節約時間，提取時間選擇在60～70 min 之間。

圖5 提取時間對得率的影響Fig.5 The effect of extraction time on the extraction yield of Monacolin K

3.2 響應面法優化青稞紅曲中兩種Monacolin K 提取工藝

3.2.1 響應面分析方案與結果

對兩種Monacolin K 提取工藝進行響應面分析，其具體試驗方案及結果見表2。

表2 試驗分析方案及實驗結果Table 2 Box-Behnken design arrangement and the experimental results

采用Design-Expert 8.0 軟件進行二次回歸響應面分析，得到Monacolin K 得率Y 對提取溫度A、液固比B、提取時間C 的二次多項回歸模型:

酸型Monacolin K 得率:Y1=2.47-0.0025A+0.041B+0.069C-0.050AB-0.020AC+0.052BC-0.096 A2-0.11B2-0.22C2

內酯型Monacolin K 得率:

各因素的方差分析見表3、4。

表3 酸型Monacolin K 提取的二次響應面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model of extracting acid form Monacolin K

表4 內酯型Monacolin K 提取的二次響應面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model of extracting lactone form Monacolin K

從表3 可以看出，Y1模型P=0.0003＜0.01，此時Y1回歸模型極其顯著，表明該試驗方法可靠。失擬項P=0.1015＞0.05，檢驗為不顯著，說明Y1回歸模型與實測值能較好的擬合。Y1模型相關系數R2=0.9656，表明可信度良好;=0.9213，說明92.13%的實驗數據可用該模型進行解釋。綜上，Y1模型可以對酸型Monacolin K 提取工藝進行分析和預測。從F 值可以看出，影響酸型Monacolin K 得率的各因素按影響大小排序依次為C(提取時間)、B(液固比)、A(提取溫度)，其中C 達到極顯著水平。

從表4 可以看出，Y2模型P=0.0001＜0.01，此時Y2回歸模型極其顯著，表明該試驗方法可靠。失擬項P=0.1239＞0.05，檢驗為不顯著，說明Y2回歸模型與實測值能較好的擬合。Y2模型相關系數R2=0.9737，表明可信度良好;=0.9399，說明93.99%的實驗數據可用該模型進行解釋。綜上，Y2模型可以對內酯型Monacolin K 提取工藝進行分析和預測。從F 值可以看出，影響內酯型Monacolin K得率的各因素按影響大小排序依次為C(提取時間)、B(液固比)、A(提取溫度)，其中C 幾乎達到極顯著水平。

等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。根據回歸方程，作出響應面和等高線，考察擬合響應曲面的形狀，從中分析提取溫度、液固比和提取時間對Monacolin K 得率的影響，結果見圖6、7。

對于Y1模型:由圖6 和表3 可以觀察到，液固比和超聲提取時間對應的酸型洛伐他汀Monacolin K 得率響應曲面為開口向下的凸形曲面，隨著因素的增大，響應值增大，當響應值增大到極值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減小。且只有BC 的P=0.0491＜0.05，所以說明液固比和超聲提取時間之間有較強的交互作用，其余各因素間的交互作用不明顯。

圖6 提取溫度和液固比(A)、提取溫度和超聲提取時間(B)及液固比和超聲提取時間(C)對酸型Monacolin K 得率影響的等高線圖和響應面Fig.6 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and liquid/solid ratio(A)，extraction temperature and extraction time(B)，liquid/solid ratio and extraction time(C)on the extraction yield of acid form Monacolin K

圖7 提取溫度和液固比(A)、提取溫度和超聲提取時間(B)及液固比和超聲提取時間(C)對內酯型Monacolin K 得率影響的等高線圖和響應面Fig.7 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and liquid/solid ratio(A)，extraction temperature and extraction time(B)，liquid/solid ratio and extraction time(C)on the extraction yield of lactone form Monacolin K

對于Y2模型:由圖7 和表4 可以觀察到，液固比和超聲提取時間對應的內酯型洛伐他汀Monacolin K 得率響應曲面為開口向下的凸形曲面，隨著因素的增大，響應值增大，當響應值增大到極值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減小。且只有BC 的P=0.0255＜0.05，所以說明液固比和超聲提取時間之間有較強的交互作用，其余各因素間的交互作用不明顯。

3.2.2 青稞紅曲中兩種Monacolin K 提取工藝條件

通過軟件中Optimization 的Numerical 功能，優化提取青稞紅曲中Monacolin K 的理論最佳工藝為:提取溫度為59.77 ℃，液固比為20.94∶1 mL/g，提取時間為64.70 min，酸式洛伐他汀Monacolin K 最大得率預測值為2.48134 mg/g，內酯型洛伐他汀Monacolin K 最大得率預測值為1.66217 mg/g。為檢驗RSA 法的可靠性，采用上述最優提取條件進行Monacolin K 提取試驗。為操作便利，將最佳條件修正為提取溫度為60 ℃，液固比為20∶1 mL/g，提取時間為60 min，實際測得青稞紅曲中酸型Monacolin K得率2.51 mg/g，內酯型Monacolin K 得率1.65 mg/g。結果證明，Monacolin K 得率與理論預測值相當，故優化方案得到的提取條件準確可靠，具有實用價值。

4 結論

響應面法克服了正交設計只能處理離散的水平值和不能給出直觀圖形，并無法找出整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值的缺陷［6-9］。本文采用響應面法研究青稞紅曲中Monacolin K 提取工藝參數，并通過響應面圖直觀分析了各因素及因素之間對青稞紅曲中Monacolin K 得率的影響，優化提取青稞紅曲中Monacolin K 的理論最佳工藝為:提取溫度為59.77 ℃，液固比為20.94∶1 mL/g，提取時間為64.70 min。結合單因素實驗對最佳工藝進行修正確定最佳提取條件:以純甲醇為提取溶劑，提取時間為1 h，液固比20∶1 mL/g，提取溫度60 ℃，得到青稞紅曲中酸型Monacolin K 得率為2.51 mg/g，內酯型Monacolin K 得率為1.65 mg/g。此外，本文建立了HPLC 測定青稞紅曲中兩種Monacolin K 含量的方法，該方法克服了以往多數研究只測定紅曲中Monacolin K 總量或只檢測內酯型Monacolin K 含量，從而忽視二者比例的缺陷，不能較好體現青稞紅曲的降脂價值［10-12］。通過本實驗優化了青稞紅曲中Monacolin K 提取工藝及含量測定方法，為青稞紅曲中Monacolin K 的進一步研究提供理論基礎。

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