反柄紫芝中二個新生物堿

田 磊，王心龍，王彥志，程永現*

1 河南中醫學院，鄭州 450008;2中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室，昆明 650201

靈芝是我國傳統名貴中藥，素有“仙草”之美稱，最早記載于《神農本草經》，被列為上品［1］，靈芝屬種類較多，《中華人民共和國藥典》僅收載了赤芝(Ganoderma lucidum)或紫芝(G.sinensis)的干燥子實體作為藥材正品來源［2］，其實靈芝屬多種真菌在我國民間被廣泛應用并在藥材市場流通。以往研究發現靈芝可調節人體代謝和內分泌功能，對免疫系統、神經系統、心血管系統、呼吸系統等均具有較好的干預效果，同時還具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、抗炎等作用［3］，臨床上或民間被廣泛用于治療多種疾病，如慢性支氣管炎、消化不良、神經衰弱、慢性肝炎、高血壓、腫瘤、AIDS 等［4］。雖然靈芝屬的研究已進行多年，但其化學成分多局限于三萜、多糖和生物堿［5，6］，近年，我們從靈芝中發現了一系列活性雜萜，引起了業界高度關注［7-9］。反柄紫芝與紫芝功能相近，形態上反柄紫芝的柄是反背而生，前期我們對其進行了研究，曾報道靈芝雜萜cochlearols A和B 的結構及其腎保護作用［10］。進一步對其進行深入研究過程中，從中分離得到6 個化合物，其中2個為新生物堿，該研究將進一步豐富人們對靈芝化學的認識。

1 儀器與材料

Shimazu UV2401PC 紫外可見光分光光度計，Waters Xevo TQ-S 質譜儀及API QSTAR Pulsar i 質譜儀;Bruker AM-400 及Avance III 600 MHz 核磁共振儀(TMS 作為內標，δ 為ppm，J 為Hz);200～300目柱色譜用硅膠、硅膠H 和GF254 薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠);45～75 μm MCI gel CHP 20P(日本三菱公司產品);25～100 μm Sephadex LH-20(Pharmacia 公司);40～63 μm RP-18(日本Daiso)。

反柄紫芝于2013 年9 月購自中國廣東省廣州同康藥業有限公司，樣品經中國科學院昆明植物研究所楊祝良研究員鑒定，憑證標本(CHYX-0570)保存于中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室。

2 提取與分離

取反柄紫芝子實體100 kg，粉碎后用70%的乙醇室溫提取(6×300 L×48 h)，濃縮得總提物(10 kg)。總提物用水適當稀釋后用乙酸乙酯萃取3 次，得到乙酸乙酯部分2 kg。經硅膠色譜柱進行分離，以氯仿-甲醇(100∶1～1∶1)梯度洗脫，得到7 個組分(F1～F7)。F5(61 g)經MCI gel CHP 20P 柱以甲醇-水(10%～100%)梯度洗脫得到3 個組分(F5.1、F5.2、F5.3)。F5.2(14 g)經正相柱硅膠色譜柱，以氯仿-甲醇(50∶1～1∶1)梯度洗脫得到4 段組分(F5.2.1～F5.2.4)。F5.2.3(3 g)經Sephadex LH-20 柱(MeOH)，RP-18 柱，以甲醇-水(50%～70%)洗脫，得到化合物1(4 mg)和2(1 mg)。F5.2.4(4 g)經MCI gel CHP 20P 柱，以甲醇-水(10%～50%)梯度洗脫，制備薄層，用氯仿-甲醇(10∶1)展開，再經Sephadex LH-20 柱(MeOH)，得化合物3(2 mg)。F5.3(5 g)經RP-18 柱，以甲醇-水(60%～90%)洗脫，再經 Sephadex LH-20 柱(MeOH)，得化合物4(2 mg)、5(6 mg)和6(1 mg)。

3 結構鑒定

化合物1 黃色粉末，由13C NMR、DEPT 譜及高分辨質譜{m/z:228.1022［M+H］+(calcd for C14H14NO2，228.1025)}確定其分子式為C14H13NO2，計算其不飽和度為9。化合物1 的1H NMR 譜芳香區出現三個質子信號［δH7.27(1H，brs)，δH6.78(2H，overlapped)］，提示結構中可能含有一個ABX 系統;低場區的二個質子信號δH8.38(1H，s)和δH7.85(1H，s)，提示結構中還可能含有一個1，2，4-三取代芳雜環;高場區顯示三個亞甲基信號［δH3.02(2H，t，J=7.5 Hz)，δH2.98(2H，t，J=7.5 Hz)，δH2.15(2H，q，J=7.5 Hz)］。13C NMR 和DEPT 譜顯示14個碳信號，包括3 個sp3雜化的亞甲基，5 個sp2雜化的次甲基，6 個烯區/芳香區季碳。以上信號與化合物sinensine D 相似［11］，提示它們是類似物，其區別在于化合物sinensine D 的6-OH 在化合物1 中消失，這可從1H-1H COSY 譜中H-4/H-5/H-6(δH2.98)的相關加以證明(圖1)，同時，H-4/C-3，C-9和H-6/C-7，C-8 的HMBC 相關也進一步表明了五元環的連接位置(圖1)。化合物1 與sinensine D 的另一區別是化合物sinensine D 中的酚羥基已成環，而化合物1 中的2'-OH 是游離的，這可由1H NMR(DMSO-d6)譜顯示兩個游離羥基質子信號5'-OH(1H，δH8.88，s)和2'-OH(1H，δH13.63，s)得到證明。另外，HMBC 譜中H-6'/C-2，C-5'(δC112.9)的相關進一步證明了苯環上OH 位置。因此，化合物1 的結構得以確定，其為一個新的生物堿，命名為ganocochlearine A。

圖1 化合物1 的關鍵HMBC 和COSY 相關Fig.1 Key HMBC and COSY correlations for compound 1

化合物2 黃色粉末，由13C NMR、DEPT 譜及高分辨質譜{m/z:242.1177［M+H］+(calcd for C15H16NO2，242.1181)}確定其分子式為C15H15NO2，計算其不飽和度為9。1H NMR 譜和13C NMR 譜與化合物1 相比較較為相似，提示它們是類似物，其區別在于化合物2 較化合物1 多了一個甲基信號，HMBC譜中H3-10/C-6，C-7，C-8 的相關表明H3-10 與C-6相連。化合物1 和2 的另一區別是五元環的位置發生了變化。HMBC 譜中H-3/C-9，C-2，H-6'，H-7/C-2，H-5/C-8，C-6 的相關表明了五元環的連接位置(圖2)。至此可確定化合物2 為一個新的生物堿，命名為ganocochlearine B。

圖2 化合物2 的關鍵HMBC 和COSY 相關Fig.2 Key HMBC and COSY correlations for compound 2

化合物1 黃色粉末，UV(MeOH)λmax(log ε)343(3.83)，265(4.15)，213(4.41)nm;ESI-MS:m/z 228［M+H］+，HR-ESI-MS:m/z 228.1022［M+H］+(calcd for C14H14NO2，228.1025);1H NMR(400 MHz，CD3OD)及13C NMR(150 MHz，CD3OD)數據見表1。

化合物2 黃色粉末，UV(MeOH)λmax(log ε)336(3.33)，255(3.64)，205(4.10)nm;ESI-MS:m/z 242［M+H］+，HR-ESI-MS:m/z 242.1177［M+H］+(calcd for C15H16NO2，242.1181);1H NMR(600 MHz，CD3OD)及13C NMR(150 MHz，CD3OD)數據見表1。

表1 化合物1 和2 在氘代甲醇中的核磁共振數據Table 1 NMR data of 1 and 2 in methanol-d4(δ，ppm)

化合物3 淡黃色粉末，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:8.26(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.97(1H，d，J=7.2 Hz，H-3)，7.70(1H，m，H-7)，7.59(1H，d，J=8.0 Hz，H-8)，7.42(1H，m，H-6)，6.34(1H，d，J=7.2 Hz，H-2);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:141.6(C-2)，109.8(C-3)，180.7(C-4)，126.7(C-5)，125.3(C-6)，133.5(C-7)，119.6(C-8)，141.6(C-9)，126.1(C-10)。以上數據和文獻［12］基本一致，故確定化合物3 為2，3-dihydro-4(1H)-quinolone。

化合物4 淡黃色粉末，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.94(1H，d，J=7.2 Hz，H-3)，7.71(1H，dd，J=8.2，0.8 Hz，H-5)，7.24(1H，t-like，J=8.0 Hz，H-6)，7.12(1H，dd，J=7.6，0.8 Hz，H-7)，6.36(1H，d，J=7.2 Hz，H-2);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:132.3(C-2)，109.7(C-3)，180.8(C-4)，115.5(C-5)，116.0(C-6)，125.3(C-7)，148.3(C-8)，140.5(C-9)，127.8(C-10)。以上數據和文獻［12］基本一致，故確定化合物4 為8-hydroxy-2，3-dihydro-4(1H)-quinolone。

化合物5 白色粉末，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:3.39(1H，d，J=11.0 Hz，Ha-28)，3.15(1H，d，J=11.0 Hz，Hb-28)，2.63(1H，overlapped，Ha-12)，2.43(1H，d，J=18.2 Hz，Hb-12)，2.40(1H，overlapped，Ha-1)，2.36(1H，overlapped，Ha-2)，2.33(1H，overlapped，Ha-23)，2.24(1H，overlapped，Hb-23)，2.19(1H，overlapped，H-5)，2.19(1H，overlapped，Hb-2)，2.16(2H，overlapped，H-6)，2.08(1H，overlapped，Ha-16)，1.94(1H，overlapped，Ha-15)，1.85(1H，overlapped，Ha-22)，1.82(1H，overlapped，Hb-1)，1.77(1H，overlapped，H-17)，1.52(1H，overlapped，H-20)，1.51(1H，overlapped，Hb-16)，1.48(1H，overlapped，Hb-15)，1.38(3H，s，H-19)，1.38(3H，s，H-29)，1.33(1H，overlapped，Hb-22)，1.06(3H，s，H-30)，1.01(3H，s，H-18)，0.91(3H，d，J=6.4 Hz，H-21);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:38.2(C-1)，30.2(C-2)，176.3(C-3)，87.9(C-4)，48.6(C-5)，32.6(C-6)，74.1(C-7)，163.6(C-8)，136.4(C-9)，42.2(C-10)，202.4(C-11)，51.5(C-12)，46.2(C-13)，52.0(C-14)，30.2(C-15)，27.8(C-16)，51.1(C-17)，18.3(C-18)，25.6(C-19)，37.1(C-20)，18.3(C-21)，32.0(C-22)，31.9(C-23)，176.3(C-24)，71.4(C-28)，24.9(C-29)，24.8(C-30)。以上數據和文獻［13］基本一致，故確定化合物5 為fornicatin A。

化合物6 白色粉末，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.24(5H，m，Ar-H)，4.32(1H，m，H-6)，3.72(1H，m，H-3)，3.25(1H，d，J=4.7 Hz，Ha-11)，3.0(1H，dd，J=13.8，4.7 Hz，Hb-11)，1.42(1H，m，H-7)，0.72(3H，d，J=8.0 Hz，H-9)，0.67(3H，d，J=4.0 Hz，H-10);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:169.3(C-2，C-5)，60.8(C-3)，57.2(C-6)，39.8(C-7)，24.7(C-8)，12.0(C-9)，15.3(C-10)，39.7(C-11)，137.0(C-12)，131.7(C-13，C-17)，129.5(C-14，C-16)，128.2(C-15)。以上數據和文獻［14］基本一致，故確定化合物6 為(3S，6S)-3-［(1'S)-1-methylpropyl］-6-(phenylmethyl)-piperazine-2，5-dione。

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