槲皮素-3-O-乙酸酯、槲皮素-3-O-丙酸酯的制備及抗血小板聚集活性

朱玉鳳，薛 敏，段 煜

濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，濰坊 261053

營(yíng)養(yǎng)學(xué)和流行病學(xué)研究表明黃酮的攝入量與心血管疾病的發(fā)生率呈反比關(guān)系［1-3］。槲皮素日攝入量約占黃酮日總攝入量的60%［4］。槲皮素具有顯著的抗血小板聚集活性［5-9］，這與其防治心血管疾病有直接的相關(guān)性，因此，槲皮素在制備防治心血管疾病的功能食品和藥物中具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，槲皮素在各類(lèi)溶劑中的溶解性低、穩(wěn)定性差，特別是在水中幾乎不溶，這些性質(zhì)影響了槲皮素的生物利用度和應(yīng)用。

槲皮素的溶解性差，部分由于其平面的分子構(gòu)型。分子間緊密堆砌，不利于溶劑進(jìn)入分子間隙。通過(guò)酰化槲皮素的羥基將短脂肪烴基鏈引入槲皮素能破壞這種分子排列，從而改善溶解性。槲皮素的活性基團(tuán)包括B 環(huán)的鄰二酚羥基和C 環(huán)的4 位羰基及2、3 位間的雙鍵［10，11］。保持這些活性基團(tuán)完好，通過(guò)區(qū)域選擇性酰化，將短脂肪烴基鏈引入槲皮素的3 位羥基，這是改善溶解性而保持生物活性的最佳方法。Saija 等和Montenegro 等的研究表明，將短脂肪烴基鏈引入槲皮素的3 位羥基不僅賦予槲皮素衍生物適宜的物理化學(xué)性質(zhì)，而且保持了槲皮素的抗氧化性［12，13］。

目前，黃酮類(lèi)化合物的區(qū)域選擇性酰化多采用酶法或化學(xué)-酶結(jié)合法［14-20］，而較少采用傳統(tǒng)的化學(xué)酰化法。這是由于采用傳統(tǒng)的化學(xué)酰化法，黃酮類(lèi)化合物的多位羥基都可能被酰化而生成酰化混合物，導(dǎo)致生物活性降低甚至喪失。然而，目前有很多關(guān)于采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成其他類(lèi)黃酮衍生物的報(bào)道，報(bào)道中均采用“活性基團(tuán)保護(hù)-衍生化-去保護(hù)”的合成路線(xiàn)［21-24］。該合成路線(xiàn)為采用傳統(tǒng)化學(xué)酰化法合成黃酮區(qū)域選擇酰化衍生物提供了有價(jià)值的參考。

為了改善槲皮素的水溶性而不影響其抗血小板聚集活性，本文中以蘆丁作為原料，采用“芐化-水解-酰化-加氫還原”四步化學(xué)合成法，合成了兩個(gè)槲皮素酰化衍生物:槲皮素-3-O-乙酸酯(Q-ac)和槲皮素-3-O-丙酸酯(Q-pr)，并用反相色譜法測(cè)定了這兩個(gè)衍生物的水溶性，同時(shí)，采用體外和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定了這兩個(gè)衍生物抗二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集活性。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器:半制備高效液相色譜儀(Agilent1200，美國(guó)Agilent 公司)，核磁共振儀(AVANCE 600，法國(guó)Bruker 公司)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6410，美國(guó)Agilent 公司)，分析型高效液相色譜儀(LC-20AT，日本Shimadzu 公司)，血小板聚集儀(LBYNJ4A，北京普利生儀器有限公司)。

試劑:蘆丁(≥98%)，生化試劑，購(gòu)自南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所，臨用前在110 ℃、1.3×103Pa下放置12 h 去除結(jié)晶水;乙酸酐和丙酰氯，均為分析純，購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司;溴化芐，化學(xué)純，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，臨用前重蒸;三乙胺，分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公式，臨用前脫水;ADP，生化試劑，Sigma 公司產(chǎn)品，用前溶于生理鹽水中;鈀炭催化劑，10%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他化學(xué)試劑購(gòu)自當(dāng)?shù)鼗瘜W(xué)試劑供應(yīng)商。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭兔，體重2.0～3.0 kg，雄性，由山東魯抗制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):魯實(shí)動(dòng)證字0017075 號(hào)。

Wistar 大鼠，體重250～300 g，雄性，由山東魯抗制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):魯實(shí)動(dòng)證字0010061 號(hào)。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 Q-ac、Q-pr 的合成

以蘆丁為原料，采用四步合成路線(xiàn)“芐化-水解-酰化-加氫還原”制備Q-ac 和Q-pr。

第一步，芐化。根據(jù)Wuts 報(bào)道的方法［25］，蘆丁(24.42 g，40 mmol)和無(wú)水K2CO3(18.35g，133 mmol)依次在氮?dú)夥障录尤氲?60 mL 的DMF 中，室溫下攪拌1 h，之后緩慢滴加溴化芐(16 mL，133 mmol)。滴加完畢后，于氮?dú)夥障?0 ℃攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)完畢后，在冰浴下用10 %(體積比)的乙酸溶液調(diào)pH 為6.0，之后加入300 mL 去離子水，離心，棄上清，沉淀即為芐化產(chǎn)物。

第二步，水解。將芐化產(chǎn)物溶于600 mL 95 %(體積比)的乙醇中，加入90 mL 36 %(質(zhì)量比)的濃鹽酸，70 ℃下回流水解2 h。過(guò)濾，濾餅用去離子水洗至中性即得水解產(chǎn)物。

第三步，酰化。水解產(chǎn)物溶于200 mL 的DMF中，加入乙酸酐(44 mmol)或丙酰氯(44 mmol)和三乙胺(44 mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)。用硅膠60-GF254薄層層析板監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開(kāi)劑，乙酸乙酯/甲醇/乙酸(6∶4∶0.1，體積比)，在波長(zhǎng)為254 nm 的紫外光下觀(guān)察。反應(yīng)直到原料點(diǎn)消失為止。加入400 mL 去離子水，過(guò)濾，濾餅即為酰化產(chǎn)物。

第四步，加氫還原。酰化產(chǎn)物溶解于5 L 的乙醇/二氧六環(huán)(1∶1，體積比)的混合溶劑中，加入2 g的鈀炭催化劑，氫氣氛下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h。過(guò)濾除去催化劑，濾液真空脫溶劑即得Q-ac 或Q-pr 的粗品。

1.4 Q-ac、Q-pr 的純化

Agilent 1200 半制備高效液相色譜儀用于純化得到Q-ac 和Q-pr 的純品。色譜柱:Agilent ZORBAX-SB C18半制備柱(250×9.4 mm，5 μm)。色譜條件:上樣量200 μL;流速5 mL/min;柱溫室溫;流動(dòng)相組成，Q-ac，乙腈/水(40∶60，體積比)，Q-pr，乙腈/水(30∶70，體積比);254 nm 紫外檢測(cè)。

1.5 水溶性的測(cè)定

槲皮素、Q-ac 和Q-pr 水溶性的測(cè)定依據(jù)Bonina等采用的方法［26］。具體為，過(guò)量的化合物溶解于含2 mL 去離子水的玻璃瓶中，聚四氟乙烯塞子密封，室溫下磁力攪拌24 h，過(guò)濾。濾液為化合物的飽和水溶液，其濃度用Shimadzu LC-20AT 高效液相色譜儀測(cè)定，檢測(cè)重復(fù)10 次。色譜柱:Shimadzu Shimpack VP-ODS C18色譜柱(250×4.60 mm，5 μm)。色譜條件:上樣量20 μL;流速1 mL/min;柱溫室溫;流動(dòng)相組成，水/甲醇(30∶70，體積比);254 nm 紫外檢測(cè)。

1.6 抗血小板聚集活性的測(cè)定

1.6.1 體外實(shí)驗(yàn)

富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)的制備依據(jù)文獻(xiàn)［27］，具體為，新西蘭兔頸動(dòng)脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑的體積比為9∶1)，收集于塑料離心管中，室溫下以1400 rpm 離心8 min，取上層液即為PRP，剩余血液繼續(xù)以4000 rpm離心15 min，取上層液即為PPP。測(cè)定時(shí)，用PPP 調(diào)PRP 中的血小板數(shù)為約5×108cell/mL。

比濁法測(cè)定血小板聚集率［27］。首先用300 μL的PPP 調(diào)零，之后比濁管中加入300 μL 的PRP，藥物組分別加入不同濃度的槲皮素、Q-ac 及Q-pr 的二甲基亞砜(DMSO)溶液各3 μL(DMSO 的終體積不得超過(guò)1.0%，防止引起假陽(yáng)性結(jié)果)，陰性對(duì)照組加入3 μL 的DMSO。37℃孵育5 min 后，加入ADP溶液，使其終濃度為7 μmol/L，記錄5 min 內(nèi)的最大聚集率。血小板聚集抑制率按下式計(jì)算:抑聚率(%)=［(1-藥物組聚集率/陰性對(duì)照組聚集率)］×100

1.6.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

Q-ac、Q-pr 和槲皮素分別溶解于30%的丙二醇水溶液中。

Wistar 大鼠隨機(jī)分為4 組，每組8 只。Q-ac 組、Q-pr 組、槲皮素組分別尾靜脈注射給藥，劑量參照文獻(xiàn)［7］，均為30 μmol/kg。陰性對(duì)照組，尾靜脈注射0.5 mL 30%的丙二醇水溶液。給藥30 min 后，心臟取血。血樣處理和血漿制備與體外實(shí)驗(yàn)相同。

比濁法測(cè)定血小板聚集率。首先用300 μL 的PPP 調(diào)零，之后比濁管中加入300 μL 的PRP，37 ℃孵育5 min 后，加入ADP 溶液，使其終濃度為7 μmol/L，記錄5 min 內(nèi)的最大聚集率。血小板聚集抑制率的計(jì)算同體外實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 槲皮素的區(qū)域選擇性酰化

槲皮素分子中有五個(gè)化學(xué)性質(zhì)相似的羥基，為確保酰化選擇性發(fā)生在槲皮素的3 位羥基，我們選用蘆丁為原料，采用了“活性基團(tuán)保護(hù)-衍生化-去保護(hù)”的合成策略。合成路線(xiàn)包括四個(gè)步驟，見(jiàn)圖1。

圖1 槲皮素3-O-酰化衍生物的合成路線(xiàn)Fig.1 The four step synthetic route of quercetin-3-O-acylated derivatives

第一步，芐化。加入3.3 倍摩爾量的無(wú)水K2CO3作為催化劑，使槲皮素的3'、4'和7 位羥基形成氧負(fù)離子，而5 位羥基與4 位羰基形成分子內(nèi)氫鍵而無(wú)法形成氧負(fù)離子［28］。加入3.3 倍摩爾量的芐化溴，使氧負(fù)離子形成芐氧基，生成3'，4'，7-O-三芐基蘆丁。為了避免產(chǎn)生C-烷基化的衍生物，非質(zhì)子溶劑DMF 作為反應(yīng)溶劑。第二步，水解3'，4'，7-O-三芐基蘆丁的苷鍵，暴露3 位羥基。第三步，酰化。雖然3 位和5 位的羥基均有可能與4 位羰基形成分子內(nèi)氫鍵，但是氫鍵具有方向性和飽和性，5 位羥基更容易形成分子內(nèi)氫鍵而呈現(xiàn)反應(yīng)惰性［29］。加入稍微過(guò)量即1.1 倍摩爾量的三乙胺作為堿性催化劑和1.1 倍摩爾量的酰基供體(乙酸酐或丙酰氯)，僅3 位羥基發(fā)生酰化，生成3'，4'，7-O-三芐基-3-O-酰化槲皮素。第四步，加氫還原反應(yīng)脫去3'、4'、7 位的芐基，生成槲皮素3-O-酰化衍生物的粗產(chǎn)物。

半制備型高效液相色譜純化粗產(chǎn)物，得到兩個(gè)高度純化的Q-ac 和Q-pr，其產(chǎn)率分別為75%，81%，均為黃色粉末。

2.2 酰化衍生物的結(jié)構(gòu)表征

酰化衍生物中脂肪酰基的數(shù)量和位置由1H NMR、13C NMR 和MS 譜進(jìn)行了表征。

1H NMR 譜中，兩個(gè)酰化衍生物的3'位、4'位、7位和5 位羥基中的活潑質(zhì)子都消失了，這是3-取代槲皮素的顯著特征，如蘆丁。13C NMR 譜中，Q-ac 和Q-pr 的酯羰基碳的化學(xué)位移分別在168.50 ppm 和171.78 ppm，這表明成功將脂肪酰基引入槲皮素;槲皮素3 位碳的化學(xué)位移在136.18 ppm，而Q-ac 和Q-pr 3 位碳的化學(xué)位均向高頻移動(dòng)，分別在130.06 ppm 和130.06 ppm;此外，槲皮素2 位碳的化學(xué)位移在147.30 ppm，而Q-ac 和Q-pr 2 位碳的化學(xué)位移均向低頻移動(dòng)，分別在150.32 ppm 和156.36 ppm;衍生物和槲皮素的其它碳的化學(xué)位移相同。上述分析表明，酰化選擇性地發(fā)生在槲皮素的3 位羥基。(見(jiàn)圖1)。

酰化衍生物的MS 譜進(jìn)一步證實(shí)了其分子結(jié)構(gòu)。對(duì)于Q-ac，367.1 m/z 分子離子峰與Q-ac 和Na+的分子量之和相一致;對(duì)于Q-pr，381.1 m/z 分子離子峰與Q-pr 與Na+的分子量之和相一致。

槲 皮 素，1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:12.50(1H，s，5-OH)，10.77(1H，s，7-OH)，9.35(3H，br s，3，3'，4'-OH)，7.68(1H，d，H-2')，7.55(1H，dd，H-6')，6.89(1H，d，H-5')，6.41(1H，d，H-8)，6.19(1H，d，H-6);13C NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:176.31(C-4)，164.35(C-7)，161.20(C-9)，156.62(C-5)，148.17(C-4')，147.30(C-2)，145.53(C-3')，136.18(C-3)，122.44(C-1')，120.44(C-6')，116.07(C-5')，115.56(C-2')，103.49(C-10)，98.65(C-6)，93.81(C-8).

Q-ac，1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:7.33(1H，d，H-2')，7.27(1H，d，H-6')，6.92(1H，d，H-5')，6.48(1H，d，H-8)，6.25(1H，d，H-6)，2.68(2H，t，CH2)，1.15(3H，t，CH3);13C NMR(DMSOd6，600 MHz)δ:175.41(C-4)，168.50(C=O)，165.18(C-7)，161.58(C-9)，156.72(C-5)，150.32(C-2)，148.27(C-4’)，146.22(C-3')，130.06(C-3)，122.98(C-1')，121.12(C-6')，116.51(C-5')，115.46(C-2')，103.71(C-10)，98.85(C-6)，94.75(C-8)，20.80(CH3);ESI-MS m/z 367.1(calcd for C17H12O8·Na+，367.1)。

Q-pr，1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:12.23(1H，s，5-OH)，10.67(1H，br，s，7-OH)，9.72(3H，br s，3，3'，4'-OH)，7.33(1H，d，H-2')，7.27(1H，d，H-6')，6.92(1H，d，H-5')，6.48(1H，d，H-8)，6.25(1H，d，H-6)，2.68(2H，t，CH2)，1.15(3H，t，CH3);13C NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:175.39(C-4)，171.78(C=O)，165.18(C-7)，161.54(C-9)，157.08(C-5)，156.36(C-2)，149.78(C-4’)，145.95(C-3')，130.06(C-3)，120.98(C-1')，120.08(C-6')，116.45(C-5')，115.46(C-2')，103.89(C-10)，99.55(C-6)，94.56(C-8)，27.08(CH2)，9.32(CH3);ESI-MS m/z 381.1(calcd for C18H14O8·Na+，381.1)

2.3 Q-ac 和Q-pr 的水溶性

Q-ac、Q-pr 和槲皮素的色譜保留時(shí)間分別為5.2 min、10.13 min 和7.3 min，見(jiàn)圖2。

圖2 Q-ac(a)、Q-pr(b)和槲皮素(c)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Q-ac(a)，Q-pr(b)and quercetin(c)

經(jīng)測(cè)定，Q-ac、Q-pr 及槲皮素在水中的溶解度分別為243.27±19.27 μg/mL、8.13±0.88 μg/mL和1.98±0.11 μg/mL。Q-ac 的水溶性遠(yuǎn)大于槲皮素，溶解度是槲皮素的122.9 倍。Q-pr 的溶解度也大于槲皮素，且具有顯著性差異(P＜0.001)。說(shuō)明，通過(guò)區(qū)域選擇性酰化，在槲皮素的3 位羥基引入短脂肪烴鏈能顯著增加水溶性，這與Saija 等和Montenegro 等的研究結(jié)果相似［12，13］。這很可能是因?yàn)槎讨緹N基鏈破壞了槲皮素分子間的緊密堆砌，溶劑更容易進(jìn)入分子間隙，從而增大溶解性。隨著脂肪烴基鏈增長(zhǎng)，疏水性增大，衍生物的水溶性下降，因此Q-pr 的溶解度小于Q-ac。

Q-ac、Q-pr 及槲皮素在水中的溶解度與參考文獻(xiàn)［12，13］不一致。可能是由于色譜條件不同。Saija等［12］采用水/乙腈/四氫呋喃/三氟乙酸(58.8∶40∶1.2∶0.06)為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，Montenegro 等［13］采用乙腈/0.17 mol/L 的醋酸(35∶65)為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。對(duì)于難溶甚至不溶的槲皮素及槲皮素-3-O-脂肪酸衍生物，出峰的強(qiáng)度與其在流動(dòng)相中的溶解度及紫外吸收波長(zhǎng)有直接關(guān)系。雖然各種條件下測(cè)定的結(jié)果均不同，但都能得到結(jié)論:通過(guò)酰化將短脂肪碳鏈引入槲皮素3 位能夠改善水溶性。

2.4 抗血小板聚集活性

通過(guò)體外和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)了Q-ac、Qpr 和槲皮素抗ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3 和圖4。

圖3 Q-ac、Q-pr 和槲皮素體外抗ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集(n=6)Fig.3 Q-ac，Q-pr and quercetin inhibited platelet aggregation induced by ADP in vitro(n=6)

圖4 Q-ac、Q-pr 和槲皮素體內(nèi)抗ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集(n=6)Fig.4 Q-ac，Q-pr and quercetin inhibited platelet aggregation induced by ADP in vivo(n=6)

酰化區(qū)域選擇性地發(fā)生在槲皮素的3 位羥基，而其它活性基團(tuán)沒(méi)有變化，預(yù)期衍生化不會(huì)影響抗血小板聚集活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果正如我們預(yù)期，在體外實(shí)驗(yàn)中，Q-ac 和Q-pr 均能抑制ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集，抑聚率均呈良好的濃度依賴(lài)性(見(jiàn)圖3)。Qac、Q-pr 和槲皮素的體外IC50分別為94.1 μmol/L、204.9 μmol/L 和255.7 μmol/L。Q-ac 和Q-pr 的IC50均小于槲皮素，其中Q-ac 最小，其次為Q-pr。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Q-ac 和Q-pr 的抑聚率均大于槲皮素的抑聚率(見(jiàn)圖4)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明，Q-ac 和Q-pr 比它們的前體槲皮素具有更顯著的抗血小板聚集活性。這大概是由于Q-ac 和Q-pr 具有適當(dāng)?shù)乃苄裕谒鼈冞w移穿過(guò)水性環(huán)境插入到血小板的生物膜，并定位于疏水內(nèi)核。Saija 等人用差示掃描量熱法研究了Q-ac、Q-pr、槲皮素-3-O-棕櫚酸酯與二磷酸膽酰堿多層囊泡、單層囊泡的相互作用，認(rèn)為，引入短脂肪烴基鏈?zhǔn)归纹に匮苌锞哂辛诉m宜的物化性質(zhì)，能夠遷移通過(guò)水性環(huán)境，并與雙層膜發(fā)生相互作用［12］。這很可能是Q-ac 和Q-pr 具有比槲皮素更強(qiáng)的抗血小板聚集活性的原因。

3 結(jié)論

槲皮素具有顯著的抗血小板聚集活性，本研究用含有短脂肪烴基鏈的酰基供體選擇性酰化槲皮素的3 位羥基，生成的衍生物Q-ac 和Q-pr 具有更高的水溶性和更強(qiáng)的抗血小板聚集活性，對(duì)開(kāi)發(fā)槲皮素為防治心血管疾病的功能性食品和藥物具有研究和應(yīng)用意義。

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