Folin-Ciocalteu 比色法測定銅藻中褐藻多酚含量的研究

段海霞，林云霞，張金榮，嚴小軍，駱其君

寧波大學海洋學院 教育部應用海洋生物技術重點實驗室，寧波 315211

銅藻(Sargassum horneri)，又名丁香屋，隸屬圓子綱(Cyclospreae)、墨角藻目(Fucales)、馬尾藻科(Sargassaceae)、馬尾藻屬(Sargassum)，為北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻。銅藻在我國沿海分布廣泛，是暖溫帶海域營造海洋牧場，進行生物修復海洋生態的首選品種［1］。銅藻作為海藻工業的優質原料，已廣泛用于食品、飼料工業，具有較高的商業價值［2，3］。近年來，隨著我國海藻資源開發利用研究的快速發展，銅藻因富含多糖、褐藻多酚、巖藻黃素等多種生物活性物質而引起了人們的廣泛關注，但對其中褐藻多酚的研究不多［4］。褐藻多酚(phlorotannins)是海洋褐藻中重要的次級代謝產物，化學結構上是一類以間苯三酚為基礎骨架的獨特的多酚類化合物，其聚合度可以幾個至幾百個，并具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗心血管疾病、抗糖尿病綜合癥、保肝等多種生物活性［5-7］。嚴小軍等以Folin-Denis法測定了中國常見海藻的褐藻多酚含量，并研究了褐藻多酚含量隨海藻生長及季節的變化規律［8］。

目前，植物多酚含量測定的最常見方法——Folin-Ciocalteu 比色法［9-11］。鑒于褐藻多酚的化學結構類型為多酚類化合物，故本研究選擇Folin-Ciocalteu 比色法進行銅藻中褐藻多酚的含量測定。以沒食子酸為標準品，分別考察檢測波長、顯色溫度、顯色時間、Folin-Ciocalteu 試劑和堿液用量等測定條件對Folin-Ciocalteu 比色法的影響，確定Folin-Ciocalteu 比色法測定銅藻中褐藻多酚含量的最優條件，為銅藻中褐藻多酚提取工藝的研究提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

新鮮銅藻于2013 年5 月采自浙江溫州南麂島，樣品由寧波大學駱其君教授鑒定，編號為NJD20130501，保存于寧波大學海洋學院。

1.2 儀器

752N 紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);HH-4 數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);SB4200D 超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);BSA124S-CW 電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司);超純水儀(Pall 公司);RXZ-380B 型智能人工氣候箱(寧波江南儀器廠);移液器(德國Eppendorf 公司);1 cm 石英比色皿(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1.3 試劑

Folin-Ciocalteu 試 劑(Sigma 公 司，批 號BCBL4436V);沒食子酸標準品(Sigma 公司，批號AGM01-HOSS);其余試劑均為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 沒食子酸標準溶液的配制

精密稱取沒食子酸對照品0.100 g，用重蒸餾水完全溶解并定容至100 mL，配成質量濃度1000 μg/mL 沒食子酸儲備溶液(現配)。

2.2 沒食子酸工作液的配制

用移液管分別移取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL 的沒食子酸標準儲備液于100 mL容量瓶中，分別加水定容至刻度，搖勻，配置質量濃度分別為15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL 的沒食子酸工作液，待用。

2.3 供試品溶液的制備

稱取新鮮銅藻1.000 g 于錐形瓶中，加入50 mL 60%(V/V)乙醇溶液，40 ℃超聲提取30 min，過濾至50 mL 容量瓶，加60%乙醇定容至50 mL，待用。

2.4 Folin-Ciocalteu 法測定褐藻多酚的比色條件優化

2.4.1 檢測波長的選取

精密量取沒食子酸工作液(50 μg/mL)、供試品溶液1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，分別加水稀釋，加1.25 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應60 min，以試劑空白為對照，在400～800 nm 范圍內掃描確定最大吸收波長。

2.4.2 顯色溫度的考察

精密量取沒食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀釋，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，分別于15、20、25、30、35、40 ℃條件下避光反應60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定溶液吸光值，以考察反應溫度對比色效果的影響。

2.4.3 顯色時間的影響

取沒食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀釋，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃分別避光反應30、60、90、120、150、180 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定溶液吸光度，以確定顯色完全的最佳時間。

2.4.4 Folin-Ciocalteu 試劑的加入量

取沒食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀釋，分別加入0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定溶液吸光度，以考察Folin-Ciocalteu 試劑用量對顯色效果的影響。

2.4.5 Na2CO3溶液用量的確定

取沒食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀釋，加Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min，分別加入3.2、4.0、4.8、5.6、6.4 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定溶液吸光度，考察Na2CO3溶液用量對吸光度的影響。

2.5 標準曲線的繪制

精密量取不同濃度的沒食子酸工作液各1.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，加水稀釋，分別加入1.25 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻，3 min 后加入0.1 g/mL Na2CO3溶液4.0 mL，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，沒食子酸溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，褐藻多酚含量以沒食子酸標準品計。

2.6 Folin-Ciocalteu 法測定銅藻中褐藻多酚的方法學評價

2.6.1 穩定性實驗

精密量取同一銅藻供試品溶液按2.4 的測定條件，分別在樣品液與顯色劑反應完全(60 min)后的0、30、60、90、120 min 測定吸光度，以評價該方法在一段時間內的穩定性。

2.6.2 重現性實驗

分別取同一銅藻樣品5 份，依2.3 的方法制備供試品溶液，分別測定其多酚含量，計算結果的相對標準偏差(RSD)，以評價該方法的重現性。

2.6.3 精密度實驗

采用優化的Folin-Ciocalteu 比色法對同一銅藻供試液測定5 次，并計算結果的相對標準偏差(RSD)，以評價該方法的精密度。

2.6.4 加標回收實驗

精密量取已知含量的銅藻供試品溶液0.5 mL，6 份，分別加入1000 μg/mL 沒食子酸工作液0.14、0.14、0.17、0.17、0.20、0.20 mL，加水稀釋，混勻，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應60 min，分別測定混合樣品中褐藻多酚含量，并計算其回收率和相對標準偏差，以評價該分析方法的準確性和可靠性。

2.7 含量測定

精確量取2.3 中的銅藻供試液1.0 mL，5 份，加水稀釋，混勻，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應60 min。反應完全后，利用紫外-可見分光光度計，于760 nm 下測定體系吸光值，根據沒食子酸標準品所得標準曲線，計算銅藻供試液中褐藻多酚的含量，公式如下:

褐藻多酚含量(mg/g)=C×V/m

式中，C:銅藻供試液中多酚濃度(mg/mL);V:銅藻供試液總體積(mL);m:銅藻質量(g)。

3 結果與分析

3.1 檢測波長的確定

多酚類物質與Folin-Ciocalteu 試劑反應顯色是基于Folin-Ciocalteu 試劑中的鎢鉬酸能將多酚化合物定量氧化，自身被還原，生成藍色物質，在680～780 nm 有較大吸收，測定顯色反應后溶液的紫外-可見吸收光譜，選擇最大吸收波長作為比色法的測定波長。圖1 為沒食子酸工作液(50 μg/mL)和供試品溶液分別與Folin-Ciocalteu 試劑顯色后的全波長掃描圖，由圖1 可知，兩者均在760 nm 處有最大吸收，故選擇760 nm 為檢測波長。

圖1 沒食子酸(a)、供試品(b)和試劑空白(c)分別與Folin-Ciocalteu 試劑顯色后的全波長掃描Fig.1 Scanning spectra of gallic acid(a)，testing solutions(b)and sample blank(c)reacted with Folin-Ciocalteu reagent

3.2 顯色溫度和時間的確定

圖2 吸光度隨反應溫度的變化Fig.2 The absorbance at different reaction temperatures

酚類化合物與Folin-Ciocalteu 試劑反應需要一定顯色溫度和時間才能顯色完全。由圖2 可知，沒食子酸標準溶液在不同溫度條件下顯色，顯色溫度對比色效果影響較大，反應溫度過低、過高均不利于多酚顯色。當溫度低于30 ℃時，吸光度較小。30℃顯色，反應60 min 時，吸光度達到最大，吸光值為0.705。35～40 ℃，顯色60 min 時，吸光度逐漸減小。說明溫度高能加快顯色進程，但是溫度過高，反應體系的穩定性較差。綜合考慮顯色的完全程度和反應體系的穩定性，確定顯色溫度為30 ℃。

圖3 吸光度隨反應時間的變化Fig.3 The absorbance at different reaction times

沒食子酸標準溶液在不同溫度條件下顯色，達到最大吸光度的時間有差異。由圖3 可知，沒食子酸標準溶液與Folin-Ciocalteu 試劑在30 ℃條件下，避光反應，顯色時間60 min 內，隨著時間的延長，吸光度增大。當顯色60 min 時體系吸光度達到最大。顯色60 min 后，體系吸光度變化很小，表明顯色反應基本完全，顯色體系穩定性很好。因此，確定Folin-Ciocalteu 比色法的反應時間為60 min。

綜上所述，確定Folin-Ciocalteu 比色法測定褐藻多酚含量的顯色溫度為30 ℃，顯色時間為60 min。

圖4 吸光度隨Folin-Ciocalteu 試劑用量的變化Fig.4 The absorbance at different addition amounts of Folin-Ciocalteu reagent

3.3 Folin-Ciocalteu 顯色劑和Na2CO3加入量的確定

Folin-Ciocalteu 顯色劑的用量對顯色效果具有較大影響，由圖4 可知，Folin-Ciocalteu 試劑用量在0.75～1.75 mL 內，隨著顯色劑用量的增加，測得的吸光度增加;當Folin-Ciocalteu 試劑加入量為1.25 mL，吸光度達到最大，吸光值為0.707。當顯色劑用量超過1.25 mL 后，吸光度略有下降。因此，確定Folin-Ciocalteu 試劑的加入量為1.25 mL。

圖5 吸光度隨10% Na2CO3溶液加入量的變化Fig.5 The absorbance at different addition amount of 10%Na2CO3solution

酚類化合物與Folin-Ciocalteu 試劑反應必須在堿性條件才可以顯色，反應體系中Na2CO3溶液是顯色的支持介質。由圖5 可知:隨著Na2CO3用量的增加，體系吸光度逐漸升高，當Na2CO3用量為4.0 mL 時，吸光度達到最大。但進一步增加Na2CO3溶液吸光度變化幅度不大，因此確定0.1 g/mL Na2CO3溶液的加入量為4.0 mL。

3.4 標準曲線的繪制

精密量取不同濃度的沒食子酸工作液各1.0 mL，按照2.4 確定的最優比色條件繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=0.0138X+0.0267，相關系數R2=0.9993。表明沒食子酸質量濃度在15～50 μg/mL 范圍內，與其吸光值呈良好的線性關系，符合朗伯-比爾定律，可用于銅藻中褐藻多酚的含量測定。

3.5 Folin-Ciocalteu 法測定褐藻中褐藻多酚的方法學評價

穩定性實驗:對Folin-Ciocalteu 比色法測定的銅藻中的褐藻多酚進行穩定性實驗，反應完全后在30℃下避光放置0、30、60、90、120 min 后測定吸光值，其吸光值分別為0.508、0.501、0.499、0.512、0.499，結果表明隨著時間的延長，吸光度值略有下降，但幅度不大，相對標準偏差(RSD)為1.169%，表明120 min 內溶液穩定性良好。

精密度實驗:對Folin-Ciocalteu 比色法測定的銅藻中的褐藻多酚進行精密度實驗，同一樣液測定5次，吸光值分別為0.487、0.491、0.510、0.497、0.497，其相對標準偏差(RSD)為1.754%，表明該方法具有較高的精密度，能夠滿足樣液分析的要求。

重現性實驗:對Folin-Ciocalteu 比色法測定的銅藻中的褐藻多酚進行重現性實驗，取同一批銅藻樣品5 份，各1.0 g，精密稱定，按2.3 的方法，分別測定吸光度，吸光值分別為0.488、0.492、0.498、0.499、0.502，其相對標準偏差(RSD)1.145%，表明該方法具有良好的重現性。

加標回收率試驗:按照2.6 的方法進行加標回收試驗，由表1 可以看出采用Folin-Ciocalteu 比色法測定銅藻中褐藻多酚的加標試驗中，回收率最高的為99.36%，最低為92.50%，平均回收率96.18%，其RSD 為2.44%。結果表明，該方法具有較高的準確性和可靠性，可以用于銅藻中褐藻多酚含量的測定。

3.6 銅藻中褐藻多酚的含量

按照2.7 中的方法測定銅藻中褐藻多酚的含量分別為17.44、17.58、17.08、17.18、17.51 mg/g，其平均含量為17.36 mg/g(RSD=1.25%)。

表1 加標回收率試驗結果Table 1 Results of recovery experiment

4 結果與討論

綜上所述，考慮影響多酚含量測定的主要因素:檢測波長、顯色溫度、顯色時間、Folin-Ciocalteu 試劑和堿液用量，確定Folin-Ciocalteu 比色法測定銅藻中褐藻多酚含量的測定條件為:精密量取銅藻供品溶液1.0 mL，加水稀釋，加1.25 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 波長處測定吸光度。方法學實驗證明該方法具有操作簡單、精密度高、穩定性好、準確可靠等優點，可用于銅藻中褐藻多酚含量的測定。

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