補腎活血方中單體成分的體外炎性抑制作用研究

孫東東，閆秋瑩，劉麗萍，沈衛星，程海波

南京中醫藥大學轉化醫學研究中心 國家中醫藥管理局名醫驗方評價與轉化重點研究室 江蘇省抗腫瘤驗方研究與產業化工程實驗室，南京 210023

補腎活血方是南京中醫藥大學第一附屬醫院用于治療骨關節炎(osteoarthritis，OA)的協定處方，為深入研究補腎活血方治療骨關節炎(OA)的效應物質基礎及藥效分子機制，前期試驗采用液質聯用技術(LC-MSn)，圍繞復方進行了定性和定量分析［1-3］，確定了復方中存在的若干化合物，同時比較了配伍前后相關成分的含量變化。本研究結合文獻查閱，選取出5 種在復方提取液中分離得到，并且文獻報道有明確或潛在治療OA 活性的單體作為體外炎癥試驗對象，他們分別是芍藥苷［4］、阿魏酸［5］、白藜蘆醇［6］、蛇床子素［7］、補骨脂素［8］。TNF-α、IL-6 及NO是目前已經驗證的，與炎癥有關或與OA 相關的細胞因子，這些炎性因子在OA 的發病過程中起著重要調節作用，可以加速關節軟骨基質的分解代謝［9-12］。本實驗采用酶聯免疫法(ELISA)測定芍藥苷等5 種單體成分及復方水提部位，對脂多糖(LPS)刺激誘導的RAW264.74 小鼠巨噬細胞釋放炎癥介質TNF-α、IL-6、NO 的抑制作用，方法快速、便利、準確，對于評價和驗證復方OA 治療活性，闡明藥效分子機制，探究效應物質基礎具有重要意義。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC 系統(四元泵溶劑系統，在線脫氣機和自動進樣器，美國Waters 公司)，Xevo TQ型質譜檢測器(美國Waters 公司)，MassLynxTM 型質譜工作站軟件(美國Waters 公司)，BT125 型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);EPED 超純水系統(南京易普達易科技發展有限公司);TGL16 型低溫高速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司);RE-52A 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);SY-1220 型水浴鍋(美國Crystal 公司);1300SeriesA2 型無菌操作臺(美國Thermo scientific 公司);無菌CO2恒溫培養箱(美國Thermo scientific 公司);酶標儀(美國Thermo scientific 公司)。

獨活、桑寄生、懷牛膝、淫羊藿、當歸、川芎、白芍、虎杖、制天南星等藥材，均購自安徽亳州，經南京中醫藥大學陳建偉教授對照2010 版藥典(一部)的藥材標準，進行定性和相關指標定量分析，鑒定為正品;芍藥苷(批號:0736-9811)、阿魏酸(批號:0773-9910)、白藜蘆醇(批號:10040-201201)、蛇床子素(批號:0822-9802)、補骨脂素(批號:739-8701)等標準品均購于中國藥品生物制品檢定所;脂多糖(LPS，1 mg/mL，Sigma 公司)、1640 培養基(Gibico公司)、FBS(上海四季青公司)、胰酶(批號:27250018，Gibico 公司)、DMSO(批號:20110105，上海凌風)、小鼠TNF-α ELISA 試劑盒(批號:EM004-96，規格96t，上海依科賽生物制品有限公司)、小鼠IL-6 ELISA 試劑盒(批號:EM008-96，規格96t，上海依科賽生物制品有限公司)、NO ELISA 試劑盒(批號:S0021-2，規格200t，江蘇碧云天生物技術研究所);乙腈、甲酸(色譜純，德國Merk 公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純;RAW264.74 小鼠巨噬細胞(批號:13-00302，上海漢博生物科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 LC-MS 樣品制備

獨活等復方藥材合并后加入8 倍量水，煎煮3次，時限分別為1、1、0.5 h，過濾后合并濾液，95%乙醇沉淀，離心后取上清液濃縮至干，精密稱取0.1000 g 浸膏用50%甲醇定容至200 mL 容量瓶，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，供液質連用分析;剩余浸膏供藥效試驗使用。

2.2 LC-MS 條件

色譜分離及質譜分析檢測條件參考前面的定性和定量分析實驗相關參數［1-3］，取樣錐孔電壓、碰撞能量等5 種化合物的主要質譜檢測參數參見表1。

表1 5 種化合物的主要質譜檢測參數Table 1 The main MS detection parameters of 5 targeted compounds

2.3 細胞鋪板［13］

用1640 培養基+10%FBS 培養小鼠巨噬細胞RAW264.74(培養條件:5% CO2，37℃恒溫培養)，待細胞長至適量后，用0.25%胰酶消化細胞，計數，稀釋至1×105個/mL，以200 μL/孔的量鋪至48 孔板中。放入無菌培養箱中，繼續培養24 h。

2.4 給藥方法及分組

用1640 培養基將LPS 稀釋至500 μg/L，芍藥苷、阿魏酸、白藜蘆醇、蛇床子素、補骨脂素及復方水提部位等分別用DMSO 溶解使其濃度為1×105μg/mL，而后用培養基將待測試藥分別稀釋至100、20 μg/mL。吸凈孔中培養基，將稀釋后的試藥依次加入300 μL，實驗分設陰性對照組(不加藥)，LPS 對照組(只加LPS)，芍藥苷組(LPS+20 μg/mL 芍藥苷、LPS+100 μg/mL 芍藥苷)，阿魏酸組(LPS+20 μg/mL 阿魏酸、LPS+100 μg/mL 阿魏酸)，白藜蘆醇組(LPS+20 μg/mL 白藜蘆醇、LPS+100 μg/mL白藜蘆醇)，蛇床子素組(LPS+20 μg/mL 蛇床子素、LPS+100 μg/mL 蛇床子素)，補骨脂素組(LPS+20 μg/mL 補骨脂素、LPS+100 μg/mL 補骨脂素)，復方水提部位組(LPS+20 μg/mL 復方水提部位、LPS+100 μg/mL 復方水提部位);每組設三個復孔。將48 孔板置于無菌培養箱繼續培養24 h。

2.5 檢測方法

收集細胞上清液，在4 ℃下，10 000 rpm 離心2 min 后，吸取上清液，按照說明書中檢測步驟處理上清液，最后用酶標儀以450 nm 為檢測波長，檢測TNF-α、IL-6 水平;以540 nm 為波長，檢測NO 水平。按照試劑盒說明書要求進行操作，以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，根據樣品OD 值計算樣品細胞因子濃度，并記錄。

2.6 數據計算及統計分析

抑制率(%)=100%-(加藥組C 值-空白對照C值)/(LPS 組C 值-空白組C 值)(C 為細胞因子濃度);應用SPSS 12.0 軟件進行統計分析，各組檢測結果以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 補腎活血方中化合物的檢測

結合LC-MS 測定，通過軟件積分，文獻比對和數據分析，確定補腎活血方中確實存在芍藥苷、阿魏酸、白藜蘆醇、蛇床子素及補骨脂素等化合物。

3.2 對LPS 誘導RAW264.74 細胞釋放TNF-α，IL-6 及NO 的抑制作用

對根據酶標儀所測結果進行數據分析，與空白組比較，模型組TNF-α、IL-6、NO 含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，阿魏酸、白藜蘆醇及補骨脂素在100 μg/mL，以及蛇床子素在20、100 μg/mL 均對TNF-α 的釋放具有顯著的抑制(P＜0.01)，并且它們的最高抑制率強于復方水提部位;阿魏酸及補骨脂素在100 μg/mL，白藜蘆醇及蛇床子素在20、100 μg/mL 均對IL-6 水平具有顯著的抑制(P＜0.01)，并且它們的最高抑制率強于復方水提部位;芍藥苷在100 μg/mL，阿魏酸、白藜蘆醇、蛇床子素及補骨脂素在20、100 μg/mL 均對NO 的釋放具有顯著抑制(P＜0.01)，并且阿魏酸、白藜蘆醇、蛇床子素、補骨脂素的最高抑制率均強于復方水提部位。從實驗數據來看，樣品濃度與TNF-α、IL-6 及NO 的釋放抑制率基本是呈正相關系，僅發現補骨脂素在20 μg/mL 濃度時對于 NO 釋放的抑制率為93.46%，大于在100 μg/mL 濃度時的抑制率81.31%，該現象有待進一步探究其原因。實驗具體數據與結果見表2～4。

表2 復方中5 種單體對LPS 誘導RAW264.74 細胞釋放TNF-α 的抑制作用Table 2 The inhibition effects of 5 components in recipe on TNF-α released by LPS-induced RAW264.74 cell

注:±s，n=3，加藥組與LPS 模型對照組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01。Note:±s，n=3，compared with LPS group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01.

表3 復方中5 種單體對LPS 誘導RAW264.74 細胞釋放IL-6 的抑制作用Table 3 The inhibition effects of 5 components in recipe on IL-6 released by LPS-induced RAW264.74 cell

表4 復方中5 種單體對LPS 誘導RAW264.74 細胞釋放NO 的抑制作用Table 4 The inhibition effects of 5 components in recipe on NO released by LPS-induced RAW264.74 cell

4 討論

TNF-α 可激活多型棱細胞，刺激滑膜細胞的PGE 產生，增加骨、軟骨的破壞。鄧康夫等通過對TNF-α 的研究指出，TNF-α 以促滑膜成纖維細胞樣細胞增殖作用為主，并因其增強滑膜細胞RNA 的表達功能，而使滑膜組織纖維性變大及滑液中細胞因子水平異常升高，從而改變關節的力學特征和軟骨細胞的生活微環境，而成為參與OA 關節軟骨退變的途徑之一［9］。IL-6 又稱B 細胞分化因子，其作用與B 細胞功能相關聯，IL-6 可激活B 細胞和T 細胞，通過其自分泌形式作用于軟骨細胞，促進軟骨細胞的增殖［10］。NO 是多種細胞因子的信號分子，介導它們發揮生物學作用。正常情況下，NO 起著宿主防疫作用，但過量的NO 可導致各種慢性炎癥。OA 發病早期，受損裸露的軟骨細胞在周圍細胞因子的作用下誘發誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)蛋白表達，從而導致NO 大量釋放。NO 又進一步促進炎癥細胞因子釋放，從而抑制軟骨細胞分泌細胞外基質和合成Ⅱ型膠原，影響軟骨的營養交換，使軟骨處在一個不良的微環境中，最終導致軟骨質量不斷下降和進行性退化［11］。作為具有明確功能和效應的炎癥介質，抑制細胞TNF-α、IL-6 及NO 的釋放水平，對于緩解炎癥癥狀、控制炎癥進程具有重要意義。

復方中的多種成分對于TNF-α、IL-6 及NO 的釋放顯示了不同程度的抑制作用，這正驗證了中藥藥效以及復方治療的多靶點效應;復方其他的提取部位以及廢棄的醇沉部位是否具有炎癥因子釋放抑制效應，這是我們活性實驗需要補充努力的方向，為復方的多功能、不同藥效找到科學實驗依據;此外對于這些部位或成分還可以探索開展針對其他炎性因子的抑制效應研究，為更深層次的藥理藥效評價、作用機制分析提供支撐;另外補骨脂素在20 μg/mL的實驗濃度時對于NO 的釋放抑制率為93.46%，大于在100 μg/mL 濃度時的抑制率81.31%，其是否屬于實驗誤差，還是具有雙向調節機制作用，需要進一步探究其原因。

目前臨床上治療OA，主要采用非甾體抗炎藥、鎮痛劑以及關節注射透明質酸鈉等手段，但是實際療效往往并不理想，經常加重OA 的發病程度，延長病情;補腎補血方作為一個治療OA 的臨床驗方，實踐證明其療效確切、安全可行;OA 從中醫的角度應歸于痹癥范疇，痹癥往往伴隨大量的炎癥反應，所以說如何有效結合中醫的病機研判，從治則、治法等角度，通過藥效實驗，揭示復方治療和干預的協同機制。反證中醫的病機理論，提升完善中醫理論，較好地達到醫藥結合，中藥研究與中醫理論的科學呼應，這也是我們復方研究下一步的重點和方向。

1 Sun DD(孫東東)，Xu XF(徐曉芳)，Yan SH(嚴世海)，et al.Analysis on chemical components from water extract of Angelicae pubescentis Radix by high performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole-time of flightmass spectrometry.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2014，26:69-76.

2 Sun DD(孫東東)，Xu XF(徐曉芳)，Liu LP(劉麗萍)，et al.Content determination of twelve kinds of active ingredients in compound Bushen Huoxue Formula with UPLC-ESI-TQMS.China J Tradit Chin Med Pharm(中華中醫藥雜志)，2014，29:1587-1590.

3 Sun DD(孫東東)，Xu XF(徐曉芳)，Cui JC(崔九成)，et al.Analysis on chemical components from water extract of Paeoniae Radix Alba by high performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole-time of flight-mass spectrometry.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2013，38:1760-1765.

4 Zheng SC(鄭世存)，Li XY(李曉宇)，Ouyang B(歐陽兵)，et al.Research development on pharmacological of paeoniflorin.Chin J Pharmacovigilance(中國藥物警戒)，2012，9:100-103.

5 Huang F(黃豐)，Deng HM(鄧華明)，Zhu MM(朱苗苗)，et al.Inhibitory effect of ferulic acid on inflammatory response in microglia induced by lipopolysaccharides.Zoologic Res(動物學研究)，2011，32:311-316.

6 Shen JL(沈皆亮)，Hu ZM(胡偵明)，Zhong XM(鐘小明)，et al.Resveratrol stimulates extracellular matrix synthesis in degenerative nucleus pulposus cells via upregulation of SIRT1.Chin J Cell Mol Immunol(細胞與分子免疫學雜志)，2012，28:1146-1150.

7 Ming LG(明磊國)，Wang MG(王鳴剛)，Chen KM(陳克明)，et al.Effect of osthol on apoptosis and bone resorption of osteoclasts cultured in vitro.Acta Pharm Sin(藥學學報)，2012，47:174-179.

8 Zhai YK(翟遠坤)，Pan YL(潘亞磊)，Niu YB(牛銀波)，et al.Comparative studies on the differentiation and maturation of rat calvarial osteoblasts by psoralen and isopsoralen in vitro.Chin Pharm Bull(中國藥理學通報)，2012，28:355-361.

9 Deng LF(鄧廉復)，Chai BF(柴本甫)，Yang QM(楊慶銘).Effects of tumor necrosis factor-α on proliferation and RNA expression of human osteoarthritic synoviocytes.Chin Pharmacol Bull(中國藥理學通報)，1998，14:506-508.

10 Li YN(李憶農).Cytokines and osteoarthritis.Chin J Rheumatol(中華風濕病學雜志)，2000，4:56-58.

11 Jin DD(金大地)，Sun W(孫煒)，Wang JX(王吉興)，et al.Potential clinical evaluation of nitric oxide synthase inhib-itor for the treatment of osteoarthritis.Chin J Orthop(中華骨科雜志)，2002，22:367-371.

12 Yang XJ(楊曉軍)，Miao WL(苗文麗)，Pei L(裴林)，et al.Influence of the Tianxing Jiangu recipe on the serum interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha of adjuvant arthritis in rats.Chin J Basic Med Tradit Chin Med(中國中醫基礎醫學雜志)，2013，19:1284-1286.

13 Xu SY(徐叔云)，Bian RL(卞如濂)，Chen X(陳修).Methodology in Pharmacological Experiment，Third Edition.Beijing:People＇s Health Publishing House，2003.1785.