榅桲總多酚的純化工藝及PTP1B 抑制作用研究

哈及尼沙，阿力木江·阿布力孜，阿米娜，阿吉艾克拜爾·艾薩*

1 新疆醫科大學藥學院;2 中國科學院干旱區植物資源化學重點實驗室 中國科學院新疆理化技術研究所，烏魯木齊 830011

榅桲(Cydonia oblonga Mill.)是薔薇科(Rosaceae)榅桲屬(Cydonia)植物榅桲的成熟果實［1］。榅桲有濃郁香味，酸甜，性溫無毒。榅桲在新疆民間被當作水果、藥品及調料品使用，具有補身益心、增益精神力、助胃利水、止渴止咳、止血止瀉、開胃等作用，相傳已有數百年應用歷史［2］。據典籍記載及現代研究表明，榅桲具有較高的食用和藥用價值，是維吾爾醫常用藥材［3，4］。榅桲中主要有效成分是多酚類化合物［5-7］，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗病毒等活性［8-12］。目前對榅桲中多酚類物質的提取、純化方面沒有發現相關文獻報道。

大孔樹脂為一種有機高聚物吸附劑，具有吸附、富集、分離不同母核結構化合物的功能［13］。該方法具有設備簡單、操作方便、節省能源、成本低、產品純度高、不吸潮等優點，應用于多酚類成分的富集、純化有較好的效果［14］。

本研究從11 種大孔吸附樹脂中篩選出對榅桲總多酚具有良好吸附和解吸性能的樹脂，探索適宜的純化條件;同時對榅桲總多酚進行PTP1B 抑制作用的研究，為合理開發利用榅桲資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榅桲采自新疆克州上阿圖什鄉，經中科院新疆生態與地理研究所植物分類研究室沈觀冕研究員鑒定為薔薇科榅桲屬植物榅桲(Cydonia oblonga Mill.)的果實;HPD-100、HPD-300、HPD-450、HPD-750 型大孔吸附樹脂，上海五維化工科技有限公司;D101 型大孔吸附樹脂，上海摩速科學器材有限公司;D140、NKA-9、AB-8、X-5、DM130 型大孔吸附樹脂，南開大學化工廠;ADS-17 型大孔吸附樹脂，山東魯抗醫藥股份有限公司;沒食子酸對照品(批號:110831-20120)，中國食品藥品檢定研究院;其他試劑均為國產分析純。

UV-2550 型紫外分光光度儀，日本島津;Buchi R-210 型旋轉蒸發儀，瑞士Buchi 公司;YP5120 型電子分析天平，上海光正醫療儀器有限公司;HH-4 型智能數顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司;HZQ-F160 型全溫震蕩培養箱，金壇市萬華實驗儀器廠;SpectraMax MD5 型酶標儀，美谷分子儀器有限公司;DZF-6020 型真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沒食子酸標準曲線的繪制

精密稱取沒食子酸對照品6.1 mg，加水溶解并定容至100 mL，搖勻，制成濃度為61 μg/mL 的對照品溶液。準確吸取沒食子酸對照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0 和4.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加磷鉬鎢酸溶液1.0 mL，加蒸餾水14 mL，再用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以沒加對照品的溶液作為空白，在500～900 nm 波長范圍光譜掃描，確定757 nm 處的最大吸收為檢測波長，測定各標準溶液的吸光度。以吸光度(A)為縱坐標，濃度(C，μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為A=0.1196C+0.0408，相關系數r=0.9993。結果表明，在沒食子酸質量濃度為1.22～9.76 μg/mL 范圍內吸光度和濃度保持較好的線性關系。

1.2.2 榅桲總多酚粗提物的制備

稱取榅桲果實粉末約250 g，在乙醇體積濃度60%、料液比1∶40(g/mL)、提取時間1 h、溫度80 ℃的條件下回流提取2 次，合并提取液減壓濃縮至無乙醇味，干燥得粗多酚浸膏，加蒸餾水超聲溶解配制榅桲總多酚提取液(藥液質量濃度為1.630 g/mL)，備用。

1.2.3 大孔吸附樹脂的預處理

分別稱取AB-8、D-140、X-5、HPD-100、HPD-450、HPD-300、HPD-750、ADS-17、D-101、DM-130、NKA-9 型等11 種大孔吸附樹脂各3.0 g，分別加入30 mL 無水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，用濕法裝柱。用無水乙醇以2 BV/h 的流速淋洗樹脂至流出液加入蒸餾水后不呈現白色渾濁為止，再用蒸餾水以同樣的流速洗至無醇味。然后用5% HCl 溶液以2 BV/h 流速通過樹脂并浸泡3 h，用蒸餾水洗至中性。再用2% NaOH 溶液，以2 BV/h 流速通過樹脂并浸泡3 h，用蒸餾水洗至中性。

1.2.4 大孔吸附樹脂的篩選

1.2.4.1 大孔樹脂對榅桲總多酚吸附率的測定

準確稱取預處理過的大孔樹脂各2.0 g，置于磨口錐形瓶中，分別加入樣品液30 mL，密封，搖勻，在室溫放置24 h，時時振搖至吸附平衡。分別精密量取各樹脂吸附后的溶液0.4 mL 于25 mL 容量瓶中，顯色后于757 nm 處測定吸光度，計算各濾液中總多酚的濃度，按下面的公式計算總多酚吸附量和吸附率。

吸附量(mg/g 樹脂)=［(C0-C1)×V1］/W

吸附率(%)=［(C0-C1)/C0］×100

式中:C0為初始樣品液質量濃度(mg/mL);C1為吸附后上清液中樣品液質量濃度(mg/mL);V1為加入樣品液體積(mL);W 大孔吸附樹脂質量(g)。

1.2.4.2 大孔樹脂對榅桲總多酚解吸率的測定

將上述吸附飽和的11 種大孔樹脂過濾后，加入60%的乙醇溶液30 mL，密封后搖勻，在室溫放置24 h，時時振搖，使榅桲總多酚解吸附，過濾，精密量取各樹脂解吸附后的溶液0.4 mL，于25 mL 容量瓶中，顯色，測定吸光度，計算各種樹脂對榅桲總多酚的解吸率。

解吸率t(%)=［(C2×V)/(W×CA)］×100

式中:CA 為吸附量(mg/g 樹脂);C2為解吸液中多酚液質量濃度(mg/mL);V 為所加乙醇的體積(mL);W 為大孔吸附樹脂質量(g)。

1.2.5 大孔樹脂動態吸附-解吸條件的優化

由篩選實驗選出一種理想大孔吸附樹脂，按

1.2.3 方法先進行預處理，濕法裝入1.5×25.0 cm層析柱中，分別考察上樣液質量濃度、上樣量、上樣流速和洗脫液濃度、洗脫液用量、洗脫流速等進行動態吸附及解吸實驗，確定最佳工藝條件。

1.2.6 PTP1B 抑制作用的研究

將用大孔吸附樹脂純化前后的榅桲多酚按照文獻［15］方法，即樣品用適量DMSO 溶解，取1 μL 加入至200 μL 反應體系中(pH 6.0，1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl，5 mmol/L DDT，50 mmol/L 檸檬酸)，加入底物pNPP 至10 mmol/L，加人人重組PTP1B(PROSPEC)0.5 μg 開始反應，37 ℃保溫30 min，加入10 mmol/L NaOH 20 μL 終止反應，用酶標儀在405 nm 測定吸收度(A)值，以原釩酸鈉作為陽性對照，以不加PTP1B 為空白對照，計算抑制率:

抑制率=(OD405空白-OD405樣品)/OD405空白×100%

應用Origin 軟件計算IC50值，以此判斷榅桲總多酚對PTP1B 的抑制能力。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

如表1 所示，11 種大孔吸附樹脂對榅桲多酚的吸附率和解吸率均有不同。其中對榅桲多酚的吸附量較大的三種樹脂依次為HPD-300、HPD-100、AB-8型樹脂。這可能是大孔樹脂的吸附原理主要為物理吸附，比表面積越大，表面張力隨之增大，吸附量就會提高。這三種樹脂的解吸率看，前兩種樹脂的解吸率低，AB-8 型大孔樹脂的解吸率在11 種樹脂中最高(79.68%)。AB-8 型大孔樹脂比表面積中等，且具有較大的孔徑，吸附-解吸綜合性能比較合理，因此選擇AB-8 型大孔吸附樹脂來分離純化榅桲總多酚。

表1 11 種大孔樹脂的性質和靜態吸附與解吸數據Table 1 Physical properties and static adsorption-desorption rate of 11 macroporous resins

2.2 大孔吸附樹脂動態吸附條件的優化

2.2.1 上樣液濃度的選擇

將榅桲多酚樣品液稀釋成0.02、0.04、0.06、0.08、0.16 g/mL 等不同濃度的上樣液，以2 BV/h的流速上樣，測定流出液中榅桲總多酚的濃度，計算吸附量。結果如圖1 所示，當樣液濃度小于0.04 g/mL 時，隨著樣液濃度的增加，吸附量增大，但高于0.04 g/mL 后多酚吸附率又有所降低。所以，并不是濃度越大吸附效果越好，藥液的澄清度也會影響樹脂的吸附效果，上樣液濃度過大時，榅桲多酚在樹脂內部擴散速度減慢，賭賽樹脂空隙而影響吸附。因此，選擇上樣液質量濃度為0.04 g/mL。

圖1 上樣液濃度對吸附量的影響Fig.1 Effect of sample concentration on adsorption capacity

2.2.2 上樣液流速的選擇

取0.04 g/mL 榅桲提取液9 BV，分別以1、2、3、4 BV/h 的流速進行吸附，測定流出液中榅桲多酚的濃度，計算出吸附量。由圖2 可知，隨著上樣流速的增加，吸附量整體呈下降趨勢。上樣液流速越慢，被吸附物質能充分擴散到樹脂的內表面，從而吸附的越完全［16］。為了節省時間，選擇上樣液流速以2 BV/h 較為適宜。

圖2 上樣流速對吸附量的影響Fig.2 Effect of sample flow rate on adsorption capacity

2.2.3 上樣量的選擇

取榅桲粗提取液以2 BV/h 的流速上柱后，分步收集漏出液，每20 mL(1 BV)收集1 個流份，測定漏出液中榅桲多酚的濃度。結果如圖3 所示，隨著上樣量的增加，流出液中榅桲多酚質量濃度不斷上升，上樣量從9 BV 開始，泄露速度趨于比較穩定，即9～14 BV 達到一個動態平衡。上樣量達到15 BV時，流出液與上樣液總酚含量幾乎相等。但上樣量過多，不僅會使純化周期將延長，工作效率降低，而且會影響多酚總收率。綜合考慮，選擇上樣量為11 BV。

圖3 AB-8 大孔樹脂對榅桲多酚的動態吸附曲線Fig.3 Adsorption curve of C.oblonga polyphenols on AB-8 resin

2.3 大孔吸附樹脂動態解吸條件的優化

2.3.1 除雜用水量的選擇

將已吸附榅桲多酚提取液飽和的AB-8 樹脂柱，用水以1、2、3、4、5 BV/h 流速洗脫，測定流出液中總多酚含量。由圖4 可知，開始時有少量未被吸附的多酚沖洗下來，當用水量到3 BV 時，流出液接近無色，水洗脫體積3 BV 后開始有微量多酚被洗脫，因此選擇水洗脫體積為3 BV。能快速淋洗樹脂柱以除去蛋白質、多糖等水溶性雜質。

圖4 除雜用水量的選擇Fig.4 Selection of the volume of elution water

2.3.2 洗脫劑濃度的選擇

取0.04 g/mL 榅桲提取液11 BV 上AB-8 大孔樹脂柱后，首先用蒸餾水3 BV 洗去雜質，然后依次用30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇水溶液各3 BV 洗脫，每1 BV 收集1 個流份，測定榅桲多酚的質量濃度，計算解吸率。由圖5 可知，榅桲多酚的解吸率隨著乙醇體積分數不同有差別，乙醇濃度50%和60%時解吸率分別為80%和79%。因此，以50%乙醇溶液作為最佳洗脫劑。

圖5 不同乙醇濃度洗脫榅桲多酚曲線Fig.5 Elution curve of C.oblonga polyphenols with different concentrations of ethanol

2.3.3 洗脫液流速的選擇

取0.04 g/mL 榅桲提取溶液11 BV，以2 BV/h流量上樣吸附，依次用3 BV 體積蒸餾水洗脫，分別用50%的乙醇溶液以1、2、3 BV/h 的速度洗脫，收集洗脫液，分別測定洗脫液中榅桲多酚的濃度。如圖6 所示，當洗脫流速小于2 BV/h 時，榅桲多酚質量濃度隨著流速的增大而增大;洗脫流速大于2 BV/h 時，質量濃度隨著洗脫流速的增大而減小。這是由于洗脫流速太慢時，解吸時間長、解吸的雜質多;2 BV/h 時洗脫液中榅桲多酚達到最大質量濃度，因此選擇2 BV/h 為最佳洗脫液流速。

圖6 洗脫液流速的選擇Fig.6 Selection of elution rate

2.3.4 洗脫液體積的選擇

按上述2.2 中選擇的上樣條件進行層析，吸附之后，用3 BV 蒸餾水快速洗去水溶性雜質。用50%乙醇溶液，流速為2 BV/h 進行洗脫，每1 BV 收集1 個流份，分別測定各流份中榅桲多酚的質量濃度。如圖7 所示，洗脫液用量在2 BV 以內時，洗脫液中多酚濃度隨洗脫液用量增大而升高，用量大于2 BV 后，50%乙醇洗脫液中多酚量隨洗脫體積的增大逐漸減少，到5 BV 時，洗脫液中幾乎已無多酚，考慮到生產成本，選擇洗脫液體積為4 BV。

圖7 洗脫體積的選擇Fig.7 Selection of elution volume

2.4 驗證試驗

按上述所確定的純化榅桲多酚的吸附和洗脫條件，重復試驗3 次，收集洗脫液，濃縮干燥的純化物浸膏總多酚質量濃度為30.11 mg/g，是粗提物(9.55 mg/g)的3 倍。

表2 榅桲總多酚的PTP1B 抑制活性Table 2 The inhibition activity of total polyphenols from C.oblonga on PTP1B

2.5 榅桲多酚對蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制作用的研究

將得到的榅桲總多酚提取物進行PTP1B 抑制作用的研究。如表2 所示，榅桲總多酚對PTP1B 有較強的抑制作用，用大孔樹脂純化后活性明顯提高。陽性對照原礬酸鈉的IC50為1.81 μg/mL。

3 結論

通過考察11 種大孔吸附樹脂，確定AB-8 型大孔樹脂對榅桲多酚有較好的吸附和解吸性能，適用于榅桲總多酚的純化。最佳純化條件為:上樣濃度為0.04 g/mL，上樣量為11 BV，上樣流速為2 BV/h，用3 BV 蒸餾水除雜后，以50%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫液用量為4 BV，流速為2 BV/h 進行洗脫。在此條件下，經AB-8 樹脂純化后，榅桲總多酚質量濃度達到了30.11 mg/g，是粗提物的3 倍。而且榅桲總多酚對PTP1B 有較強的抑制作用，其IC50為16.14 μg/mL。實驗表明，經樹脂純化，去除了大量的雜質，提高了總多酚的含量和PTP1B 抑制作用，對榅桲總多酚有較好的精制效果。

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