離體培養人腸道菌群對九節龍皂苷I 生物轉化的研究

曹偉宇，王鵬遠，馮 斌，王曉娟

軍事口腔醫學國家重點實驗室 第四軍醫大學口腔醫院藥劑科，西安 710032

九節龍(Ardisia pusilla A.DC.)系紫金牛科紫金牛屬植物，主要含三萜皂苷類成分，九節龍皂苷I(Ardipusilloside I，ADS I)(圖1)［1］是從該全草中提取出來的三萜皂苷，體外細胞試驗表明，九節龍皂苷I 對肝癌、胃癌、卵巢癌、肺癌等8 種人癌細胞均有良好的抑制活性［2］。體內動物實驗表明，荷瘤動物經ADS I 灌胃后對小鼠肉瘤(S37、S180)、Lewis 肺癌及裸鼠肝癌SMMC-7721 等實體瘤均有顯著的抑制作用［3-6］。而ADS I 藥代動力學研究顯示，ADS I本身幾乎不能被大鼠腸道吸收，其可能在大鼠腸道菌群作用下轉化為新的物質，進入大鼠體內循環的成分經質譜全掃描初步推測為ADS I 的系列脫糖代謝產物［7］，而這些產物可能才是對荷瘤動物模型發揮抗腫瘤作用的物質基礎。ADS I 是三萜皂苷，有溶血性，無法通過靜脈給藥，而口服給藥，腸道吸收差，生物利用度低，這已成為ADS I 等皂苷類新藥研發的瓶頸。皂苷經口服到達靶器官起作用的活性物質，很大一部分是經腸道菌群生物轉化后的活性代謝產物，因此從皂苷的代謝產物中尋找活性更強、藥動學性質更好的抗腫瘤活性成分是突破上述瓶頸的重要手段之一［8，9］。有文獻報道，人參皂苷(如Rg1、Rc、Rg3)等多種天然皂苷均可被人腸道菌轉化，產生的代謝物對腫瘤細胞具有抑制作用［10-12］。本實驗通過研究ADS I 與離體培養人腸道菌群作用，經提取分離純化過程，應用HPLC-ELSD 和UHPLC-ESIMS/MS 技術分析推斷其可能代謝產物結構，擬闡明ADS I 經人腸道菌代謝的可能途徑，比較ADS I 在人與大鼠腸道的代謝差異，進而尋找ADS I 發揮抗腫瘤作用的體內物質基礎，為其臨床研究提供依據。

圖1 ADS I 化學結構式Fig.1 Chemical structure of ADS I

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀(日本島津科技公司);Alltech 3300 型蒸發光散射檢測器(美國Grace公司);1290 Infinity 超高效液相色譜(UHPLC)-6460型三重串聯四極桿液質聯用儀，配有電噴霧離子源(ESI)及Mass Hunter 工作軟件(美國Agilent 科技公司);BT125D 電子天平(德國Sartorius 公司)，MLS-3180 型高壓蒸汽滅菌器(日本三洋公司)，A85 厭氧培養工作站(英國Don Whitley Scientific 公司)，Analytic 超純水儀(英國ELGA 公司);旋轉蒸發儀(上海申生有限公司)。

1.2 材料與試劑

普通厭氧培養基(GAM)購于青島高科園海博生物技術有限公司，ADS I(實驗室自制，純度＞95%)［13］，甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher 公司)，其它均為分析純。

2 實驗方法

2.1 HPLC-ELSD 條件

色譜柱:Diamonsil C18(2)(4.6×250 mm，5μm)(北京迪馬科技公司);流動相:甲醇(A)-水(B)梯度洗脫，0～12 min，75%A，12～30 min，75%～90%A，進樣量10 μL，流速1 mL/min，柱溫25 ℃;ELSD:漂移管溫度60 ℃，氣體流速2.0 L/min，增益1。

2.2 UHPLC-MS 條件

色譜柱:Poroshell 120 EC-C18柱(2.1×100 mm，2.7 μm)(美國Agilent 科技公司)，流動相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，0～15 min 35%A，15～16 min 35～50%A，16～30 min 50%A，進樣量:2 μL，流速:0.4 mL/min，柱溫:25 ℃。離子源類型:ESI，檢測模式:負離子模式，干燥氣:N2，干燥氣溫度:350 ℃，干燥氣流速:10 L/min，毛細管電壓:-3500 V，碎裂器電壓:380 V，霧化器壓力:45 psi，鞘氣溫度:350 ℃，鞘氣流速:11 L/min，質量掃描范圍:m/z 100～1200。

2.3 厭氧培養液的配制

取厭氧培養基約9.5 g 置燒杯中，加適量純水，水浴中攪拌使溶解，冷卻后轉移并定容至1000 mL量瓶中，NaOH 調pH 到7.0～7.5，即得GAM 培養液，0.07 MPa 115 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后備用。

2.4 人腸道菌培養液的配制［14，15］

取新鮮健康志愿者的糞便10 g，加入300 mL 厭氧培養液，用玻璃棒打碎、攪拌均勻，多層紗布過濾3 次，即得人腸道菌培養液。

2.5 ADS I 在人腸道菌培養液中的代謝

稱取4 份ADS I 粉末各約10 mg，置50 mL 無菌離心管中，先用100～200 μL 甲醇溶解，再加入50 mL 厭氧培養液，振搖使其充分溶解，另取不加ADS I 的人腸道菌培養液作為空白對照。所有樣品均放入厭氧培養系統中，37 ℃恒溫密閉培養8、24、48、72 h，按照時間點取出各樣品。將樣品用50 mL 水飽和的正丁醇:乙酸乙酯(1∶1)混合溶劑萃取3 次，合并上層萃取液，旋轉蒸發儀75 ℃減壓濃縮，經水浴蒸干后其殘渣用甲醇復溶，按照上述HPLC-ELSD 和UHPLC-MS 條件分別進行分析，記錄色譜圖和質譜圖。

3 實驗結果

3.1 HPLC-ELSD 分析

通過對ADS I 的人腸道菌培養物進行檢測后發現，相對于空白培養液，隨著培養時間延長，ADS I逐漸轉化產生代謝產物M1、M2 和M4。8～24 h 時，只檢測到M1，其含量逐漸升高，48 h 時M1 含量達到最高，同時檢測到M2，72 h 時，M1 相對減少，M2相對增加，同時新檢測到M4(見圖2)。

初步推斷厭氧培養條件下ADS I 經人腸道菌代謝后產生了新的物質，根據保留時間推斷這些代謝物的極性均小于ADS I，這一結果符合三萜皂苷類物質在腸道菌以脫糖代謝方式轉化為比原藥極性小的次生苷或苷元的規律，且結果顯示ADS I 在人腸道菌中代謝48 h 后再無新的代謝物產生，代謝72 h后各代謝物的含量幾乎趨于平衡。

圖2 ADS I 與人腸道菌培養后的HPLC-ELSD 色譜圖Fig.2 HPLC-ELSD chromatograms of ADS I incubated with human intestinal bacteria

3.2 UHPLC-ESI-MS/MS 分析

根據文獻報道，串聯四級桿質譜通過適度調節破碎電壓(Fragmentor voltage)可以獲得相對豐富的碎片離子［16，17］。本實驗采用較高的破碎電壓(F=380V)的策略對ADS I 及代謝物在負離子模式下進行全掃描，得益于質譜的高靈敏度，發現培養48 h后的樣品能檢測出HPLC-ELSD 未檢出的新代謝物M3，培養72 h 的樣品中四種代謝物的含量趨于平衡，其提取離子流圖及全掃描質譜圖見圖3。根據準分子離子峰推算出代謝物的分子量，通過適當增大破碎電壓和碰撞能量進行子離子掃描使其產生更多的碎片離子，再根據ADS I 的質譜裂解規律及獲取的多級質譜碎片離子信息對代謝物的結構進行推斷，各化合物的保留時間、分子質量、多級質譜碎片信息等數據見表1。

圖3 ADS I 人腸道菌培養72h 的提取離子流圖及代謝物全掃描質譜圖Fig.3 Selected ion chromatogram of the extract of ADS I and human intestinal bacteria and full-scan mass spectra of the metabolites

表1 ADS I 及代謝產物的色譜和質譜數據Table 1 Retention time，possible formula and MS data of ADS I and its metabolites

本實驗在電噴霧負離子模式下進行全掃描得到ADS I 及其代謝物M1～M4 的準分子離子峰［MH］-m/z1073、911、765、603、471，結合ADS I 的化學結構，可以初步推斷M1～M4 可能為ADS I 的脫糖基產物。為進一步研究系列代謝產物的結構，通過調整質譜碎裂電壓和碰撞能量獲得更多特征碎片離子信息，ADS I 的［M-H］-離子(m/z 1073)可產生碎片離子m/z 927、765、603，再以m/z 927 為母離子進行MS2分析產生碎片離子m/z 765、603、471。代謝物M1 的［M-H］-離子(m/z 911)相對ADS I 少了162Da，MS2分析也產生m/z 765、603、471 等碎片離子，故可推斷M1 是ADS I 代謝脫去末端一分子葡萄糖的化合物。代謝物M2 的［M-H］-離子(m/z 765)相對M1 少了146 Da，可產生碎片離子m/z 603、471，由上文HPLC-ELSD 檢測結果推斷M2 可能是由M1 轉化而來，故可推測M2 是M1 脫一分子鼠李糖得到的化合物，同理可推斷M3 是在M2 基礎上脫去1 分子葡萄糖的產物，M4 是在M3 基礎上再脫去一分子阿拉伯糖的產物。與已報道文獻不同的是［7］，ADS I 經人腸道菌的代謝產物和經大鼠腸道菌的代謝產物不盡相同，質譜分析結果表明，ADS I經大鼠腸道菌群作用后產生特有的化合物X1，而人腸道菌群作用后檢測到特有的化合物X2，即代謝產物M3，二者推測結構見圖4。ADS I 及其代謝產物的可能質譜裂解途徑見圖5。

4 討論與結論

圖4 ADS I 經人和大鼠腸道菌轉化產生的特有代謝產物可能結構(X1 大鼠，X2 人)Fig.4 The possible structures of specific metabolites of ADS I transformed by human and rat intestinal bacteria(X1 rat，X2 human)

圖5 ADS I 及代謝物可能裂解途徑Fig.5 The possible fragmentation pathway of ADS I and its metabolites

本實驗通過體外模擬人腸道菌群對ADS I 的生物轉化作用，利用HPLC-ELSD 和UHPLC-ESI-MS/MS 技術對其代謝產物進行檢測分析，采用靈活調整破碎電壓和碰撞能量的策略讓串聯質譜產生更豐富的碎片離子信息，首次對ADS I 的離體人腸道菌代謝物進行質譜裂解規律解析，初步推斷出M1、M2、M3、M4 四種代謝產物的結構。其中代謝產物M1、M2、M4 與ADS I 在大鼠腸道代謝的產物相同，均為ADS I 分別脫去c 糖、(c+d)糖及(a+b+c+d)糖后形成的次生苷及苷元［7］。值得注意的是，ADS I經大鼠腸道菌群作用后產生特有的脫去了d 糖的化合物X1，而經人腸道菌群作用后形成特有的脫去了(b+c+d)糖的化合物X2(即M3，二者可能結構見圖4)，暗示由于人和動物腸道菌群的組成差異，ADS I 的腸道菌轉化產物不盡相同，代謝規律各異，該結果為ADS I 在人腸道內的轉化吸收研究和進一步臨床研究提供了參考。

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